मेरे दिमाग में पता लगाने की तकनीक के इतिहास में कई क्रांतिकारी आविष्कार एंटीजन-एंटीबॉडी विशिष्ट बाइंडिंग, पीसीआर तकनीक और अनुक्रमण तकनीक के सिद्धांत पर आधारित इम्यूनोलेबलिंग तकनीक हैं।आज हम बात करेंगे पीसीआर तकनीक के बारे में।पीसीआर तकनीक के विकास के अनुसार, लोग आदतन पीसीआर तकनीक को तीन पीढ़ियों में विभाजित करते हैं: साधारण पीसीआर तकनीक, वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर तकनीक और डिजिटल पीसीआर तकनीक।
Cओमन पीसीआर तकनीक
कैरी मुलिस (1944.12.28-2019.8.7)
कैरी मुलिस ने 1983 में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन, पीसीआर) का आविष्कार किया था। ऐसा कहा जाता है कि जब वह अपनी प्रेमिका को गाड़ी चला रहे थे, तो अचानक उनके मन में प्रेरणा की चमक आई और उन्होंने पीसीआर के सिद्धांत (ड्राइविंग के लाभों पर) के बारे में सोचा।कैरी मुलिस को 1993 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था। न्यूयॉर्क टाइम्स ने टिप्पणी की: "अत्यधिक मौलिक और महत्वपूर्ण, जीव विज्ञान को लगभग पूर्व-पीसीआर और पोस्ट-पीसीआर युग में विभाजित करना।
पीसीआर का सिद्धांत: डीएनए पोलीमरेज़ के उत्प्रेरण के तहत, मदर स्ट्रैंड डीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है, और विशिष्ट प्राइमर को विस्तार के शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है, और मदर स्ट्रैंड टेम्पलेट डीएनए के पूरक बेटी स्ट्रैंड डीएनए को विकृतीकरण, एनीलिंग, विस्तार और अन्य चरणों के माध्यम से इन विट्रो में कॉपी किया जाता है।यह इन विट्रो में एक डीएनए संश्लेषण प्रवर्धन तकनीक है, जो इन विट्रो में किसी भी लक्ष्य डीएनए को तेजी से और विशेष रूप से बढ़ा सकती है।
साधारण पीसीआर के लाभ
1.क्लासिक विधि, पूर्ण अंतरराष्ट्रीय और घरेलू मानक
2.उपकरण अभिकर्मकों की कम लागत
3.पीसीआर उत्पादों को अन्य आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों के लिए पुनर्प्राप्त किया जा सकता है
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साधारण पीसीआर के नुकसान
1.प्रदूषित करना आसान
2.बोझिल ऑपरेशन
3.केवल गुणात्मक विश्लेषण
4.मध्यम संवेदनशीलता
5.गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होता है, और जब गैर-विशिष्ट बैंड लक्ष्य बैंड के समान आकार का होता है, तो इसे अलग नहीं किया जा सकता है
Cएपिलरी वैद्युतकणसंचलन-आधारित पीसीआर
साधारण पीसीआर की कमियों के जवाब में, कुछ निर्माताओं ने केशिका वैद्युतकणसंचलन के सिद्धांत पर आधारित उपकरण पेश किए हैं।पीसीआर प्रवर्धन के बाद वैद्युतकणसंचलन चरण केशिका में पूरा हो जाता है।संवेदनशीलता अधिक है, और कई आधारों के अंतर को पहचाना जा सकता है और MAERKER द्वारा प्रवर्धन की गणना की जा सकती है।उत्पाद सामग्री.नुकसान यह है कि पीसीआर उत्पाद को अभी भी खोलने और उपकरण में डालने की आवश्यकता है, और अभी भी संदूषण का एक बड़ा खतरा है।
CएपीलरीEलेक्ट्रोफोरेसिस
2. वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर (मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर, क्यूपीसीआर) तकनीकफ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर, जिसे रियल-टाइम पीसीआर भी कहा जाता है, 1995 में पीई (पर्किन एल्मर) द्वारा विकसित एक नई न्यूक्लिक एसिड मात्रात्मक तकनीक है। फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर का विकास इतिहास एबीआई, रोशे और बायो-रेड जैसे दिग्गजों के आत्मा-सरगर्मी संघर्षों का इतिहास है।यदि आप रुचि रखते हैं, तो आप इसे देख सकते हैं।यह तकनीक वर्तमान में सबसे परिपक्व और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर तकनीक है।
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फ्लोरोसेंट डाई विधि (एसवाईबीआर ग्रीन I):एसवाईबीआर ग्रीन I मात्रात्मक पीसीआर के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला डीएनए-बाइंडिंग डाई है, जो गैर-विशेष रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को बांधता है।मुक्त अवस्था में, SYBR ग्रीन कमजोर प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है, लेकिन एक बार डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए से बंध जाने पर, इसकी प्रतिदीप्ति 1000 गुना बढ़ जाती है।इसलिए, प्रतिक्रिया से उत्सर्जित कुल फ्लोरोसेंट सिग्नल मौजूद डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए की मात्रा के समानुपाती होता है और प्रवर्धित उत्पाद की वृद्धि के साथ बढ़ेगा।चूंकि डाई गैर-विशेष रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए से जुड़ती है, इसलिए गलत सकारात्मक परिणाम उत्पन्न हो सकते हैं।
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फ्लोरोसेंट जांच विधि (टैकमैन तकनीक): दौरानपीसीआर प्रवर्धन, एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच को प्राइमर की एक जोड़ी के साथ ही जोड़ा जाता है।जांच एक रैखिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड है, जिसके दोनों सिरों पर क्रमशः एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर समूह और एक फ्लोरोसेंट क्वेंचर समूह लेबल किया गया है।जब जांच बरकरार रहती है, तो रिपोर्टर समूह द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट सिग्नल क्वेंचर समूह द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है, और पता लगाने में कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं होता है;पीसीआर प्रवर्धन (विस्तार चरण में) के दौरान, टाक एंजाइम की 5'-3' डिसर गतिविधि जांच को पचाएगी और ख़राब करेगी, ताकि रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह और क्वेंचर फ्लोरोसेंट समूह अलग हो जाएं, ताकि प्रतिदीप्ति निगरानी प्रणाली फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त कर सके, अर्थात, हर बार जब डीएनए श्रृंखला प्रवर्धित होती है, तो एक फ्लोरोसेंट अणु बनता है, जो फ्लोरोसेंट संकेतों के संचय और पीसीआर उत्पादों के गठन के पूर्ण सिंक्रनाइज़ेशन का एहसास करता है।टैक्मैन जांच विधि नैदानिक पहचान में सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली पहचान विधि है।
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क्यूपीसीआर के लाभ
1.विधि परिपक्व है और सहायक उपकरण और अभिकर्मक पूर्ण हैं
2.अभिकर्मकों की मध्यम लागत
3.प्रयोग करने में आसान
4.उच्च पहचान संवेदनशीलता और विशिष्टता
क्यूपीसीआर के नुकसान
लक्ष्य जीन के उत्परिवर्तन से पता लगाने में चूक हो जाती है।
कम-एकाग्रता टेम्पलेट का पता लगाने का परिणाम निर्धारित नहीं किया जा सकता है।
मात्रात्मक पता लगाने के लिए मानक वक्र का उपयोग करते समय एक बड़ी त्रुटि होती है।
3. डिजिटल पीसीआर (डिजिटल पीसीआर, डीपीसीआर) तकनीक
डिजिटल पीसीआर न्यूक्लिक एसिड अणुओं की पूर्ण मात्रा निर्धारित करने की एक तकनीक है।क्यूपीसीआर की तुलना में, डिजिटल पीसीआर सीधे डीएनए/आरएनए अणुओं की संख्या को पढ़ सकता है, जो शुरुआती नमूने में न्यूक्लिक एसिड अणुओं की पूर्ण मात्रा का ठहराव है।1999 में, बर्ट वोगेलस्टीन और केनेथ डब्ल्यू किन-ज़लर ने औपचारिक रूप से डीपीसीआर की अवधारणा का प्रस्ताव रखा।
2006 में, फ्लुइडिग्म एक वाणिज्यिक चिप-आधारित डीपीसीआर उपकरण का उत्पादन करने वाला पहला था।2009 में, लाइफ टेक्नोलॉजीज ने ओपनएरे और क्वांटस्टूडियो 12K फ्लेक्स डीपीसीआर सिस्टम लॉन्च किया।2013 में, लाइफ टेक्नोलॉजीज ने क्वांटस्टूडियो 3डीडीपीसीआर सिस्टम लॉन्च किया, जो 20,000 व्यक्तिगत कोशिकाओं में नमूनों को समान रूप से वितरित करने के लिए उच्च-घनत्व नैनोस्केल माइक्रोफ्लुइडिक चिप तकनीक का उपयोग करता है।प्रतिक्रिया में अच्छी तरह से.
2011 में, बायो-रेड ने ड्रॉपलेट-आधारित QX100 dपीसीआर उपकरण लॉन्च किया, जो 20,000 ड्रॉपलेट-वॉटर-इन-ऑयल में नमूने को समान रूप से वितरित करने के लिए वॉटर-इन-ऑयल तकनीक का उपयोग करता है, और बूंदों का विश्लेषण करने के लिए एक ड्रॉपलेट विश्लेषक का उपयोग करता है।2012 में, रेनडांस ने प्रत्येक मानक प्रतिक्रिया प्रणाली को 1 मिलियन से 10 मिलियन पिकोलिटर-स्तरीय सूक्ष्म-बूंदों वाले प्रतिक्रिया इमल्शन में विभाजित करने के लिए, उच्च दबाव गैस द्वारा संचालित रेनड्रॉप डीपीसीआर उपकरण लॉन्च किया।
अब तक, डिजिटल पीसीआर ने दो प्रमुख गुट बनाए हैं, चिप प्रकार और छोटी बूंद प्रकार।इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि डिजिटल पीसीआर किस प्रकार का है, इसके मूल सिद्धांत कमजोर पड़ने, समापन बिंदु पीसीआर और पॉइसन वितरण को सीमित करना है।न्यूक्लिक एसिड टेम्प्लेट युक्त मानक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली को समान रूप से हजारों पीसीआर प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया जाता है, जिन्हें चिप्स या माइक्रोड्रॉपलेट्स में वितरित किया जाता है, ताकि प्रत्येक प्रतिक्रिया में जितना संभव हो सके एक टेम्पलेट अणु हो, और एक एकल-अणु टेम्पलेट पीसीआर प्रतिक्रिया की जाती है।प्रतिदीप्ति को पढ़कर सिग्नल की उपस्थिति या अनुपस्थिति की गणना की जाती है, और सांख्यिकीय पॉइसन वितरण के अंशांकन के बाद पूर्ण मात्रा का ठहराव किया जाता है।
मेरे द्वारा उपयोग किए गए कई डिजिटल पीसीआर प्लेटफार्मों की विशेषताएं निम्नलिखित हैं:
1. बायो-रेड QX200 ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर बायो-रेडQX200 एक बहुत ही क्लासिक डिजिटल पीसीआर प्लेटफ़ॉर्म है, मूल पहचान प्रक्रिया: 20,000 नमूने ड्रॉपलेट जनरेटर द्वारा उत्पन्न होते हैं, पानी में तेल की सूक्ष्म बूंदों को एक साधारण पीसीआर मशीन पर बढ़ाया जाता है, और अंत में प्रत्येक सूक्ष्म-बूंद के प्रतिदीप्ति संकेत को एक माइक्रो-ड्रॉपलेट रीडर द्वारा पढ़ा जाता है।ऑपरेशन अधिक जटिल है, और प्रदूषण का जोखिम मध्यम है।
Xinyi TD1 माइक्रो-ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआरXinyi TD1 एक घरेलू डिजिटल पीसीआर प्लेटफ़ॉर्म है, मूल पहचान प्रक्रिया: एक छोटी बूंद जनरेटर के माध्यम से 30,000-50,000 पानी-तेल की बूंदें उत्पन्न करती है, एक सामान्य पीसीआर उपकरण पर प्रवर्धित करती है, और अंत में ड्रॉपलेट रीडर प्रत्येक बूंद के फ्लोरोसेंट सिग्नल को पढ़ती है।इस प्लेटफ़ॉर्म में ड्रॉपलेट जेनरेशन और रीडिंग दोनों ही संदूषण के कम जोखिम के साथ एक समर्पित चिप में किए जाते हैं।
स्टिला नाइका माइक्रो-ड्रॉपलेट चिप डिजिटल पीसीआरSTILLA Naica एक अपेक्षाकृत नया डिजिटल पीसीआर प्लेटफॉर्म है।मूल पता लगाने की प्रक्रिया है: चिप में प्रतिक्रिया समाधान जोड़ें, चिप को सूक्ष्म-बूंद उत्पादन और प्रवर्धन प्रणाली में डालें, और 30,000 सूक्ष्म-बूंदें उत्पन्न करें।चिप पर फैला हुआ है, और चिप पर पीसीआर प्रवर्धन पूरा हो गया है।फिर प्रवर्धित चिप को माइक्रो-ड्रॉपलेट रीडिंग विश्लेषण प्रणाली में स्थानांतरित किया जाता है, और चित्र लेकर फ्लोरोसेंट सिग्नल को पढ़ा जाता है।चूंकि पूरी प्रक्रिया एक बंद चिप में होती है, इसलिए संदूषण का जोखिम कम होता है।
4. थर्मोफिशर क्वांटस्टूडियो 3डी चिप डिजिटल पीसीआर
थर्मोफिशर क्वांटस्टूडियो 3डी एक अन्य क्लासिक चिप-आधारित डिजिटल पीसीआर प्लेटफॉर्म है।इसकी मूल पहचान प्रक्रिया है: प्रतिक्रिया समाधान को स्प्रेडर में जोड़ें, और प्रतिक्रिया समाधान को स्प्रेडर के माध्यम से 20,000 माइक्रोवेल्स के साथ चिप पर समान रूप से फैलाएं।, एम्प्लीफाई करने के लिए चिप को पीसीआर मशीन पर रखें, और अंत में चिप को रीडर में डालें और फ्लोरोसेंट सिग्नल को पढ़ने के लिए एक फोटो लें।ऑपरेशन अपेक्षाकृत जटिल है, और पूरी प्रक्रिया एक बंद चिप में की जाती है, और संदूषण का जोखिम कम है।
5. जेएन मेडसिस क्लैरिटी चिप डिजिटल पीसीआर
जेएन मेडसिस क्लैरिटी एक अपेक्षाकृत नया चिप-प्रकार का डिजिटल पीसीआर प्लेटफॉर्म है।इसकी मूल पहचान प्रक्रिया है: एप्लिकेटर में प्रतिक्रिया समाधान जोड़ें, और एप्लिकेटर के माध्यम से पीसीआर ट्यूब में तय किए गए 10,000 पीसीआर ट्यूबों पर प्रतिक्रिया समाधान समान रूप से फैलाएं।माइक्रोपोरस चिप पर, प्रतिक्रिया समाधान केशिका क्रिया के माध्यम से चिप में प्रवेश करता है, और चिप के साथ पीसीआर ट्यूब को प्रवर्धन के लिए पीसीआर मशीन पर रखा जाता है, और अंत में फोटो खींचकर फ्लोरोसेंट सिग्नल को पढ़ने के लिए चिप को रीडर में डाल दिया जाता है।ऑपरेशन अधिक जटिल है.संदूषण का खतरा कम है.
प्रत्येक डिजिटल पीसीआर प्लेटफ़ॉर्म के पैरामीटर निम्नानुसार संक्षेपित हैं:
डिजिटल पीसीआर प्लेटफ़ॉर्म के मूल्यांकन संकेतक हैं: विभाजित इकाइयों की संख्या, फ्लोरोसेंट चैनलों की संख्या, संचालन की जटिलता और संदूषण का जोखिम।लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात पहचान की सटीकता है।डिजिटल पीसीआर प्लेटफार्मों का मूल्यांकन करने का एक तरीका एक दूसरे को सत्यापित करने के लिए कई डिजिटल पीसीआर प्लेटफार्मों का उपयोग करना है, और दूसरा तरीका सटीक मूल्यों के साथ मानक पदार्थों का उपयोग करना है।
डीपीसीआर के लाभ
1.पूर्ण परिमाणीकरण प्राप्त करना
2.उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता
3.कम प्रतिलिपि नमूनों का पता लगा सकते हैं
डीपीसीआर के नुकसान1. महंगे उपकरण और अभिकर्मक 2. जटिल संचालन और लंबे समय तक पता लगाने का समय 3. संकीर्ण पता लगाने की सीमा
वर्तमान में, पीसीआर प्रौद्योगिकी की तीन पीढ़ियों के अपने फायदे और नुकसान हैं, और प्रत्येक के अपने स्वयं के अनुप्रयोग क्षेत्र हैं, और यह कोई संबंध नहीं है कि एक पीढ़ी दूसरे की जगह लेती है।प्रौद्योगिकी की निरंतर प्रगति ने पीसीआर प्रौद्योगिकी में नई जीवन शक्ति का संचार किया है, जिससे यह एक के बाद एक अनुप्रयोग दिशाओं को अनलॉक करने में सक्षम हो गई है, जिससे न्यूक्लिक एसिड का पता लगाना अधिक सुविधाजनक और सटीक हो गया है।
स्रोत: डॉ. युआन आपको परीक्षण के लिए ले जाते हैं
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पोस्ट करने का समय: नवंबर-18-2022
