कॉलम प्लग किया गया

कॉलम प्लग करने के बाद, आरएनए उपज कम हो जाती है या आरएनए को शुद्ध करना असंभव हो जाता है, और प्राप्त आरएनए द्रव्यमान कम होता है।

सामान्य कारण विश्लेषण:

1. सैंपल ब्रेक पूरी तरह से नहीं हैं।

नमूना टूटने से डीएनए-क्लीनिंग कॉलम पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं होता है, जबकि आरएनए उपज और गुणवत्ता प्रभावित होती है।जब आप नमूने तोड़ते हैं तो हम पर्याप्त तरल नाइट्रोजन में तेजी से पीसने की सलाह देते हैं, नमूना कोशिका दीवार, कोशिका झिल्ली और अन्य ऊतकों को कुचलने का प्रयास करें।पॉलीओल पॉलीसेकेराइड के पौधों के नमूनों के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि आप प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस का उपयोग करें।

2. जब डीएनए-क्लीनिंग कॉलम के साथ अलग किए गए नमूने के सतह पर तैरनेवाला को सक्शन किया जाता है, तो संभावित कोशिका खंडित अवक्षेप को अंदर लिया जा सकता है।

ली गई कोशिका खंडित तलछट आरएनए-केवल कॉलम का कारण बनेगी जो आरएनए सोखना ऑपरेशन किए जाने पर अवरुद्ध हो जाएगी (चरण 6 देखें)।हम आपको सलाह देते हैं कि कोशिका के मलबे को चूसे जाने से बचने के लिए इस सतह पर तैरनेवाला को सक्शन करते समय सावधानी बरतें।

3. नमूना प्रारंभिक राशि बहुत अधिक है.

अत्यधिक नमूना उपयोग के परिणामस्वरूप बफर पीएसएल1 द्वारा अपूर्ण नमूना विखंडन या अपूर्ण कोशिका विश्लेषण होगा, जिसके परिणामस्वरूप शुद्धि के दौरान शुद्धि स्तंभ में रुकावट होगी।प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्रत्येक एकल शुद्ध ऑपरेटिंग नमूना 50 मिलीग्राम है।पॉलीओल पॉलीसेकेराइड के पौधों के नमूनों के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि आप प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस आज़माएँ।

4. सेंट्रीफ्यूज का तापमान बहुत कम है.

संपूर्ण आरएनए अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया कमरे के तापमान (20-25) पर की जाती है°सी), सिवाय इसके कि नमूना ऊतक तरल नाइट्रोजन से टूट जाता है। कुछ क्रायोजेनिक सेंट्रीफ्यूज का तापमान 20 से कम है℃, जो डीएनए-सफाई कॉलम और/या आरएनए-केवल कॉलम में रुकावट का कारण बन सकता है।यदि ऐसा होता है, तो सेंट्रीफ्यूज तापमान को 20-25 पर सेट करें℃, औरसुनिश्चित करें कि लाइसिस मिश्रण और/या इथेनॉल-जोड़ा गया सतह पर तैरनेवाला 37 पर पहले से गरम किया गया था°C.

कोई आरएनए नहीं निकाला गया या आरएनए उपज कम है

आमतौर पर कई कारक होते हैं जो पुनर्प्राप्ति दक्षता को प्रभावित करते हैं, जैसे: नमूना आरएनए सामग्री, संचालन विधि, निक्षालन मात्रा, आदि।

सामान्य कारणों का विश्लेषण नीचे दिया गया है:

1.ऑपरेशन के दौरान बर्फ स्नान या कम तापमान (4°C) सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया।

सुझाव: कमरे के तापमान (15-25) पर काम करें°सी) पूरी प्रक्रिया में, बर्फ स्नान और कम तापमान सेंट्रीफ्यूजेशन न करें।

2. नमूने के अनुचित संरक्षण या नमूने के दीर्घकालिक संरक्षण के कारण आरएनए का क्षरण हो गया है।

सिफ़ारिश: ताजा एकत्र किए गए नमूनों को तरल नाइट्रोजन में जल्दी से जमे हुए किया जाना चाहिए, और फिर लंबे समय तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, नमूनों को बार-बार जमने और पिघलने से बचाया जाना चाहिए;या नमूनों को तुरंत आरएनए स्टेबलाइज़र आरएनएलेटर समाधान (पशु नमूने) में भिगोएँ।

3. अपर्याप्त नमूना विखंडन और लसीका के कारण शुद्धिकरण स्तंभ में रुकावट आती है।

सुझाव: टिश्यू को पीसते समय, कृपया सुनिश्चित करें कि टिश्यू पर्याप्त रूप से पिसा हुआ है, और इसे तुरंत पहले से तैयार बफर पीएसएल1 में स्थानांतरित करें (पुष्टि करें कि β-ME का सही अनुपात जोड़ा गया है, प्रक्रिया का चरण 1 देखें)।

4.एलुएंट गलत तरीके से जोड़ा गया था।

सुझाव: सुनिश्चित करें कि RNase-मुक्त ddH2O को शुद्धिकरण स्तंभ झिल्ली के बीच में टपकाया जाता है।

5. बफर पीएसएल2 या बफर पीआरडब्ल्यू2 में पूर्ण इथेनॉल की सही मात्रा नहीं जोड़ी गई थी।

सुझाव: कृपया निर्देशों का पालन करें, बफर पीएसएल2 और बफर पीआरडब्ल्यू2 में पूर्ण इथेनॉल की सही मात्रा जोड़ें और किट का उपयोग करने से पहले अच्छी तरह मिलाएं।

6. ऊतक के नमूने की मात्रा अनुचित है।

सुझाव: बफ़र पीएसएल1 के प्रति 500 ​​μl 50 मिलीग्राम ऊतक का उपयोग करें।बहुत अधिक ऊतक का उपयोग करने से निकाले गए आरएनए की मात्रा कम हो जाएगी और परिणामी आरएनए की शुद्धता भी कम हो जाएगी।हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि प्रारंभिक नमूना खुराक प्रति आरएनए निष्कर्षण ऑपरेशन 50 मिलीग्राम से अधिक नहीं होनी चाहिए।

7. अनुपयुक्त निक्षालन मात्रा या अपूर्ण निक्षालन।

सुझाव: शुद्धिकरण स्तंभ की तरल मात्रा 50-200 μl है;यदि निक्षालन प्रभाव संतोषजनक नहीं है, तो पहले से गरम RNase-मुक्त ddH2O, जैसे 5-10 मिनट जोड़ने के बाद कमरे के तापमान पर समय बढ़ाने की सिफारिश की जाती है।

8. बफ़रPRW2 से धोने के बाद शुद्धिकरण स्तंभ में इथेनॉल अवशेष होता है।

सुझाव: यदि खाली ट्यूब को 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है और बफर पीआरडब्ल्यू2 में धोने के बाद भी इथेनॉल शेष रहता है, तो आप खाली ट्यूब सेंट्रीफ्यूजेशन का समय 2 मिनट तक बढ़ा सकते हैं, या अवशिष्ट इथेनॉल को पूरी तरह से हटाने के लिए शुद्धिकरण कॉलम को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रख सकते हैं।

9.किट का गलत इस्तेमाल किया गया.

सुझाव: पॉलीफेनोलिक पॉलीसेकेराइड के पौधों के नमूनों के लिए, प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट जैसी सामान्य किट का उपयोग करने से आदर्श आरएनए नमूने प्राप्त करने में सक्षम नहीं हो सकते हैं।हम आपको प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशनकिट प्लस का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो विशेष रूप से पॉलीफेनोलिक पॉलीसेकेराइड संयंत्र नमूनों के लिए डिज़ाइन किया गया है।पॉलीफेनोल और पॉलीसेकेराइड पौधों के नमूनों से आरएनए निकालने के लिए विशेष रूप से विकसित एक किट।

OD260/OD280 का मान कम है

डीडीएच2ओ के साथ आरएनए निक्षालन और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रीडिंग के लिए उपयोग किए जाने पर कम OD260/OD280 मान प्राप्त होते हैं।हम अपेक्षाकृत सही OD260/OD280 मान प्राप्त करने के लिए 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 (आरएनए को कम करने के लिए आरएनएएस-मुक्त डीडीएच2ओ के बजाय) का उपयोग करने की सलाह देते हैं, पृष्ठ 19 पर "आरएनए एकाग्रता और शुद्धिकरण परख" देखें।

शुद्ध आरएनए का क्षरण हो जाता है

शुद्ध आरएनए की गुणवत्ता नमूना संरक्षण, आरएनएएस संदूषण और हेरफेर जैसे कारकों से संबंधित है।

सामान्य कारणों का विश्लेषण:

1.ऊतक के नमूने एकत्र करने के बाद समय पर संग्रहीत नहीं किए गए थे।

सिफ़ारिश: यदि ऊतक के नमूने संग्रह के बाद समय पर उपयोग नहीं किए जाते हैं, तो कृपया उन्हें तुरंत कम तापमान पर तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत करें या तरल नाइट्रोजन में त्वरित ठंड के बाद दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें, या तुरंत नमूनों को आरएनए स्टेबलाइजर आरएनएलेटर समाधान (पशु नमूने) में डुबो दें।आरएनए निष्कर्षण के लिए, ताज़ा एकत्रित ऊतक नमूनों का उपयोग करने का प्रयास करें।

2.ऊतक के नमूनों का बार-बार जमना और पिघलना।

सुझाव: ऊतक के नमूनों को संग्रहीत करते समय, संरक्षण के लिए उन्हें छोटे टुकड़ों में काटना सबसे अच्छा है, और नमूनों के बार-बार जमने और पिघलने के कारण होने वाले आरएनए के क्षरण से बचने के लिए उनका उपयोग करते समय उनमें से एक हिस्सा निकाल लें।

3.RNase को ऑपरेशन रूम में पेश किया जाता है या डिस्पोजेबल दस्ताने, मास्क आदि नहीं पहने जाते हैं।

सुझाव: आरएनए निष्कर्षण प्रयोगों को अलग-अलग आरएनए ऑपरेशनों में करना सबसे अच्छा है, और प्रयोग से पहले प्रयोगशाला की मेज को साफ किया जाना चाहिए, और प्रयोग के दौरान डिस्पोजेबल दस्ताने और मास्क पहने जाने चाहिए ताकि आरएनएज़ की शुरूआत के कारण होने वाले आरएनए क्षरण से काफी हद तक बचा जा सके।

4. उपयोग के दौरान अभिकर्मक RNase द्वारा दूषित हो जाता है।

सुझाव: संबंधित प्रयोगों के लिए प्लांट टोटल आरएनए निष्कर्षण किट की एक नई श्रृंखला के साथ बदलें।

5. आरएनए हेरफेर के लिए उपयोग की जाने वाली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और पिपेट युक्तियां आरएनएएस से दूषित हैं।

सुझाव: सुनिश्चित करें कि आरएनए निष्कर्षण में उपयोग की जाने वाली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, पिपेट टिप, पिपेट आदि सभी आरएनसे-मुक्त हैं।

निर्देश पुस्तिका:

प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस निर्देश मैनुअल