• पीसीआर एक ऐसी विधि है जिसका उपयोग डीएनए टेम्पलेट की थोड़ी मात्रा से डीएनए को बढ़ाने के लिए किया जाता है।आरटी-पीसीआर एक आरएनए स्रोत से डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का उपयोग करता है जिसे फिर बढ़ाया जा सकता है।
• पीसीआर और आरटी-पीसीआर आम तौर पर समापन बिंदु प्रतिक्रियाएं हैं, जबकि क्यूपीसीआर और आरटी-क्यूपीसीआर मौजूद टेम्पलेट की मात्रा को निर्धारित करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान उत्पाद संश्लेषण की दर के कैनेटीक्स का उपयोग करते हैं।
• नए तरीके, जैसे कि डिजिटल पीसीआर, प्रारंभिक डीएनए टेम्पलेट की पूर्ण मात्रा प्रदान करते हैं, जबकि आइसोथर्मल पीसीआर जैसे तरीके विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता को कम करते हैं।

पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) डीएनए और आरएनए अनुक्रमों को बढ़ाने और पता लगाने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली आणविक जीव विज्ञान तकनीक है।डीएनए क्लोनिंग और प्रवर्धन के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, जिसमें अक्सर कई दिन लग सकते हैं, पीसीआर को केवल कुछ घंटों की आवश्यकता होती है।पीसीआर अत्यधिक संवेदनशील है और विशिष्ट अनुक्रमों का पता लगाने और प्रवर्धन के लिए न्यूनतम टेम्पलेट की आवश्यकता होती है।बुनियादी पीसीआर विधियां सरल डीएनए और आरएनए पहचान से आगे बढ़ी हैं।नीचे, हमने आपकी शोध आवश्यकताओं के लिए एंज़ो लाइफ साइंसेज में उपलब्ध विभिन्न पीसीआर विधियों और अभिकर्मकों का अवलोकन प्रदान किया है।हमारा लक्ष्य वैज्ञानिकों को उनके अगले अनुसंधान प्रोजेक्ट में उपयोग करने के लिए पीसीआर अभिकर्मकों तक शीघ्रता से पहुंचने में मदद करना है!

पीसीआर

मानक पीसीआर के लिए, आपको बस एक डीएनए पोलीमरेज़, मैग्नीशियम, न्यूक्लियोटाइड्स, प्राइमर, प्रवर्धित किया जाने वाला डीएनए टेम्पलेट और एक थर्मोसाइक्लर की आवश्यकता होती है।पीसीआर तंत्र अपने उद्देश्य के समान सरल है: 1) डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए (डीएसडीएनए) गर्मी विकृत है, 2) प्राइमर एकल डीएनए स्ट्रैंड से संरेखित होते हैं, और 3) प्राइमर डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा विस्तारित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप दो प्रतियां बनती हैं मूल डीएनए स्ट्रैंड.तापमान और समय की एक श्रृंखला में विकृतीकरण, एनीलिंग और बढ़ाव की प्रक्रिया को प्रवर्धन के एक चक्र के रूप में जाना जाता है (चित्र 1)।

चक्र के प्रत्येक चरण को उपयोग किए गए टेम्पलेट और प्राइमर सेट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।यह चक्र लगभग 20-40 बार दोहराया जाता है, और फिर प्रवर्धित उत्पाद का विश्लेषण किया जा सकता है, आमतौर पर एगरोज़ जेल द्वारा (चित्र 2)।

चूंकि पीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील विधि है और एकल प्रतिक्रियाओं के लिए बहुत छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, इसलिए कई प्रतिक्रियाओं के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करने की सिफारिश की जाती है।मास्टर मिश्रण को अच्छी तरह मिश्रित किया जाना चाहिए और फिर प्रतिक्रियाओं की संख्या से विभाजित किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक प्रतिक्रिया में एंजाइम, डीएनटीपी और प्राइमर की समान मात्रा होगी।कई आपूर्तिकर्ता, जैसे कि एंज़ो लाइफ साइंसेज, पीसीआर मिश्रण भी पेश करते हैं जिनमें प्राइमर और डीएनए टेम्पलेट को छोड़कर पहले से ही सब कुछ शामिल होता है।

गुआनिन/साइटोसिन-समृद्ध (जीसी-समृद्ध) क्षेत्र मानक पीसीआर तकनीकों में एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं।जीसी-समृद्ध अनुक्रम कम जीसी सामग्री वाले अनुक्रमों की तुलना में अधिक स्थिर होते हैं।इसके अलावा, जीसी-समृद्ध अनुक्रम माध्यमिक संरचनाएं बनाते हैं, जैसे हेयरपिन लूप।परिणामस्वरूप, विकृतीकरण चरण के दौरान जीसी-समृद्ध डबल स्ट्रैंड को पूरी तरह से अलग करना मुश्किल होता है।नतीजतन, डीएनए पोलीमरेज़ बिना किसी बाधा के नए स्ट्रैंड को संश्लेषित नहीं कर सकता है।एक उच्च विकृतीकरण तापमान इसमें सुधार कर सकता है, और उच्च एनीलिंग तापमान और कम एनीलिंग समय के लिए समायोजन जीसी-समृद्ध प्राइमरों के अनिर्दिष्ट बंधन को रोक सकता है।अतिरिक्त अभिकर्मक जीसी-समृद्ध अनुक्रमों के प्रवर्धन को बढ़ा सकते हैं।डीएमएसओ, ग्लिसरॉल और बीटाइन जीसी इंटरैक्शन के कारण होने वाली माध्यमिक संरचनाओं को बाधित करने में मदद करते हैं और इस तरह डबल स्ट्रैंड को अलग करने में मदद करते हैं।

हॉट स्टार्ट पीसीआर

अनिर्दिष्ट प्रवर्धन एक समस्या है जो पीसीआर के दौरान हो सकती है।पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश डीएनए पोलीमरेज़ 68°C से 72°C के आसपास के तापमान पर सबसे अच्छा काम करते हैं।हालाँकि, एंजाइम कम तापमान पर भी सक्रिय हो सकता है, हालाँकि कम डिग्री तक।एनीलिंग तापमान से काफी नीचे के तापमान पर, प्राइमर गैर-विशिष्ट रूप से बंध सकते हैं और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कारण बन सकते हैं, भले ही प्रतिक्रिया बर्फ पर स्थापित हो।इसे पोलीमरेज़ अवरोधकों का उपयोग करके रोका जा सकता है जो एक निश्चित तापमान तक पहुंचने के बाद ही डीएनए पोलीमरेज़ से अलग हो जाते हैं, इसलिए इसे हॉट स्टार्ट पीसीआर कहा जाता है।अवरोधक एक एंटीबॉडी हो सकता है जो पोलीमरेज़ को बांधता है और प्रारंभिक विकृतीकरण तापमान (आमतौर पर 95 डिग्री सेल्सियस) पर विकृत करता है।

उच्च निष्ठा पोलीमरेज़

जबकि डीएनए पोलीमरेज़ मूल टेम्पलेट अनुक्रम में काफी सटीकता से प्रवर्धित होते हैं, न्यूक्लियोटाइड मिलान में गलतियाँ हो सकती हैं।क्लोनिंग जैसे अनुप्रयोगों में विसंगतियों के परिणामस्वरूप प्रतिलेखों को काट दिया जा सकता है, और गलत अनुवादित या निष्क्रिय प्रोटीन डाउनस्ट्रीम में हो सकते हैं।इन बेमेलताओं से बचने के लिए, "प्रूफरीडिंग" गतिविधि वाले पोलीमरेज़ की पहचान की गई है और उन्हें वर्कफ़्लो में शामिल किया गया है।पहला प्रूफरीडिंग पोलीमरेज़, पीएफयू, 1991 में पायरोकोकस फ्यूरियसस में पहचाना गया था।इस पीएफयू एंजाइम में 3' से 5' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि होती है।जैसे ही डीएनए प्रवर्धित होता है, एक्सोन्यूक्लिज़ स्ट्रैंड के 3' सिरे पर बेमेल न्यूक्लियोटाइड को हटा देता है।फिर सही न्यूक्लियोटाइड को प्रतिस्थापित किया जाता है, और डीएनए संश्लेषण जारी रहता है।गलत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों की पहचान एंजाइम के साथ सही न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट के लिए बाध्यकारी संबंध पर आधारित है, जहां अकुशल बंधन संश्लेषण को धीमा कर देता है और सही प्रतिस्थापन की अनुमति देता है।पीएफयू पोलीमरेज़ की प्रूफरीडिंग गतिविधि के परिणामस्वरूप टाक डीएनए पोलीमरेज़ की तुलना में अंतिम अनुक्रम में कम त्रुटियां होती हैं।हाल के वर्षों में, अन्य प्रूफरीडिंग एंजाइमों की पहचान की गई है, और डीएनए प्रवर्धन के दौरान त्रुटि दर को और कम करने के लिए मूल पीएफयू एंजाइम में संशोधन किए गए हैं।

आरटी-पीसीआर

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, या आरटी-पीसीआर, एक टेम्पलेट के रूप में आरएनए के उपयोग की अनुमति देता है।एक अतिरिक्त कदम आरएनए का पता लगाने और प्रवर्धन की अनुमति देता है।रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके आरएनए को पूरक डीएनए (सीडीएनए) में रिवर्स ट्रांसक्राइब किया जाता है।आरटी-पीसीआर की सफलता के लिए आरएनए टेम्पलेट की गुणवत्ता और शुद्धता आवश्यक है।आरटी-पीसीआर का पहला चरण डीएनए/आरएनए हाइब्रिड का संश्लेषण है।रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में RNase H फ़ंक्शन भी होता है, जो हाइब्रिड के RNA हिस्से को ख़राब कर देता है।एकल-फंसे डीएनए अणु को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की डीएनए-निर्भर डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि द्वारा सीडीएनए में पूरा किया जाता है।प्रथम-स्ट्रैंड प्रतिक्रिया की दक्षता प्रवर्धन प्रक्रिया को प्रभावित कर सकती है।यहां से, सीडीएनए को बढ़ाने के लिए मानक पीसीआर प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है।आरटी-पीसीआर द्वारा आरएनए को सीडीएनए में वापस लाने की संभावना के कई फायदे हैं, और इसका उपयोग मुख्य रूप से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए किया जाता है।आरएनए एकल-फंसे और बहुत अस्थिर है, जिससे इसके साथ काम करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है।यह आमतौर पर क्यूपीसीआर में पहले चरण के रूप में कार्य करता है, जो जैविक नमूने में आरएनए प्रतिलेखों की मात्रा निर्धारित करता है।

क्यूपीसीआर और आरटी-क्यूपीसीआर

मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने, लक्षण वर्णन और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है।आरटी-क्यूपीसीआर में, आरएनए प्रतिलेखों को अक्सर पहले सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट करके परिमाणित किया जाता है, जैसा कि ऊपर बताया गया है, और फिर बाद में क्यूपीसीआर किया जाता है।मानक पीसीआर की तरह, डीएनए को तीन दोहराए जाने वाले चरणों द्वारा बढ़ाया जाता है: विकृतीकरण, एनीलिंग और बढ़ाव।हालाँकि, क्यूपीसीआर में, जैसे-जैसे पीसीआर आगे बढ़ता है, फ्लोरोसेंट लेबलिंग डेटा के संग्रह को सक्षम बनाता है।उपलब्ध विधियों और रसायन शास्त्र की श्रृंखला के कारण इस तकनीक के कई लाभ हैं।

डाई-आधारित क्यूपीसीआर (आमतौर पर हरा) में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग एक डीएसडीएनए बाइंडिंग डाई के उपयोग को नियोजित करके प्रवर्धित डीएनए अणुओं की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।प्रत्येक चक्र के दौरान, प्रतिदीप्ति को मापा जाता है।प्रतिदीप्ति संकेत प्रतिकृति डीएनए की मात्रा के अनुपातिक रूप से बढ़ता है।इसलिए, डीएनए को "वास्तविक समय" में निर्धारित किया जाता है (चित्र 3)।डाई-आधारित क्यूपीसीआर का नुकसान यह है कि एक समय में केवल एक ही लक्ष्य की जांच की जा सकती है और डाई नमूने में मौजूद किसी भी डीएस-डीएनए से जुड़ जाएगी।

जांच-आधारित क्यूपीसीआर में, प्रत्येक नमूने में एक साथ कई लक्ष्यों का पता लगाया जा सकता है, लेकिन इसके लिए प्राइमरों के अलावा उपयोग की जाने वाली लक्ष्य-विशिष्ट जांच के अनुकूलन और डिजाइन की आवश्यकता होती है।कई प्रकार के जांच डिज़ाइन उपलब्ध हैं, लेकिन सबसे आम प्रकार एक हाइड्रोलिसिस जांच है, जिसमें एक फ्लोरोफोर और क्वेंचर शामिल होता है।प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (एफआरईटी) जांच बरकरार रहने पर क्वेंचर के माध्यम से फ्लोरोफोर के उत्सर्जन को रोकता है।हालाँकि, पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, प्राइमर विस्तार और उस विशिष्ट अनुक्रम के प्रवर्धन के दौरान जांच को हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है जिससे यह बाध्य होता है।जांच की दरार फ्लोरोफोर को क्वेंचर से अलग करती है और परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति में प्रवर्धन-निर्भर वृद्धि होती है (चित्र 4)।इस प्रकार, जांच-आधारित क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया से प्रतिदीप्ति संकेत नमूने में मौजूद जांच लक्ष्य अनुक्रम की मात्रा के समानुपाती होता है।क्योंकि जांच-आधारित क्यूपीसीआर डाई-आधारित क्यूपीसीआर से अधिक विशिष्ट है, यह अक्सर क्यूपीसीआर-आधारित नैदानिक ​​​​परखों में उपयोग की जाने वाली तकनीक है।

इज़ोटेर्मल प्रवर्धन

उपरोक्त तकनीकों में वर्णित पीसीआर को विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार चरणों के लिए चैम्बर तापमान को सटीक रूप से ऊपर और नीचे करने के लिए महंगे थर्मोसाइक्लिंग उपकरण की आवश्यकता होती है।ऐसी कई तकनीकें विकसित की गई हैं जिनके लिए ऐसे सटीक उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और इन्हें साधारण पानी के स्नान में या यहां तक ​​कि रुचि की कोशिकाओं के भीतर भी किया जा सकता है।इन तकनीकों को सामूहिक रूप से इज़ोटेर्मल प्रवर्धन कहा जाता है और यह घातीय, रैखिक या कैस्केड प्रवर्धन पर आधारित होती है।

आइसोथर्मल प्रवर्धन का सबसे प्रसिद्ध प्रकार लूप-मध्यस्थ इज़ोटेर्मल प्रवर्धन, या लैंप है।LAMP टेम्पलेट DNA या RNA को बढ़ाने के लिए 65⁰C पर घातीय प्रवर्धन का उपयोग करता है।एलएएमपी प्रदर्शन करते समय, लक्ष्य डीएनए के क्षेत्रों के पूरक चार से छह प्राइमरों का उपयोग नए डीएनए को संश्लेषित करने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ के साथ किया जाता है।इनमें से दो प्राइमरों में मानार्थ अनुक्रम होते हैं जो अन्य प्राइमरों में अनुक्रमों को पहचानते हैं और उन्हें बांधते हैं, जिससे नए संश्लेषित डीएनए में एक "लूप" संरचना बनती है जो प्रवर्धन के बाद के दौर में प्राइमर एनीलिंग में सहायता करती है।LAMP को प्रतिदीप्ति, एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन, या वर्णमिति सहित कई तरीकों से देखा जा सकता है।वर्णमिति द्वारा उत्पाद की उपस्थिति या अनुपस्थिति को देखने और पता लगाने में आसानी और आवश्यक महंगे उपकरणों की कमी ने LAMP को उन क्षेत्रों में SARS-CoV-2 परीक्षण के लिए एक उपयुक्त विकल्प बना दिया जहां नैदानिक ​​​​प्रयोगशाला परीक्षण आसानी से उपलब्ध नहीं था, या नमूनों का भंडारण और परिवहन संभव नहीं था, या उन प्रयोगशालाओं में जहां पहले पीसीआर थर्मोसाइक्लिंग उपकरण नहीं थे।