पीसीआर अभिकर्मकों के प्रारंभिक चरण में प्राइमरों और जांचों के प्रदर्शन को सत्यापित करना और सबसे उपयुक्त प्रतिक्रिया स्थितियों का निर्धारण करना औपचारिक प्रयोगों की सुचारू प्रगति सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक शर्तें हैं।
तो हमें प्रारंभिक चरण में प्राइमर जांच की पुष्टि कैसे करनी चाहिए?
मुख्य संकेतक बेसलाइन, एम्प्लीफिकेशन कर्व, सीटी वैल्यू, एम्प्लीफिकेशन दक्षता, कम-एकाग्रता नमूना पहचान, सीवी, आदि हैं।
आधारभूत
आधार रेखा पीसीआर प्रवर्धन वक्र में क्षैतिज रेखा है।पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के पहले कुछ चक्रों में, प्रतिदीप्ति संकेत ज्यादा नहीं बदलता है और एक सीधी रेखा बनाता है।यह सीधी रेखा आधार रेखा है।
पीसीआर प्राइमर जांच की स्क्रीनिंग करते समय, इस बात पर ध्यान दें कि बेसलाइन समतल है या नहीं।प्राइमर जांच एकाग्रता की शुद्धता बेसलाइन को प्रभावित करेगी, जैसे कि बेसलाइन का बढ़ना या गिरना।आधार रेखा भी एक बहुत ही सहज संकेतक है।
प्रवर्धन वक्र
एक अन्य सहज संकेतक प्रवर्धन वक्र का आकार है।द्वितीयक प्रवर्धन या अन्य असामान्य प्रवर्धन वक्रों से बचने के लिए एस-आकार का वक्र रखना सबसे अच्छा है।
सीटी मान
आधार रेखा से घातीय वृद्धि तक विभक्ति बिंदु के अनुरूप चक्रों की संख्या सीटी मान है।
एक ही नमूने के लिए, अलग-अलग प्राइमर जांच के परिणामस्वरूप अलग-अलग प्रवर्धन वक्र बनते हैं, और संबंधित सीटी मान प्रवर्धन दक्षता और हस्तक्षेप की डिग्री से प्रभावित होगा।सिद्धांत रूप में, हमारे द्वारा चुने गए प्राइमर जांच का सीटी मान जितना छोटा होगा, उतना बेहतर होगा।
प्रवर्धन दक्षता
पीसीआर प्रवर्धन दक्षता के मूल्यांकन के लिए सबसे विश्वसनीय और स्थिर तरीकों में से एक मानक वक्र है, जिसे शोधकर्ताओं द्वारा भी व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है।इस विधि में लक्ष्य टेम्पलेट्स की सापेक्ष संख्या को नियंत्रित करने के लिए नमूनों की एक श्रृंखला बनाना शामिल है।ये नमूने आमतौर पर संकेंद्रित स्टॉक समाधानों के क्रमिक तनुकरण द्वारा बनाए जाते हैं, सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला 10 गुना तनुकरण है।पतले नमूनों की एक श्रृंखला का उपयोग करते हुए, Cq मान प्राप्त करने के लिए मानक qपीसीआर प्रोग्राम का उपयोग करके प्रवर्धन करें, और अंत में रैखिक समीकरण Cq= -klgX0+b, और प्रवर्धन दक्षता E=10(-1 /k)-1 प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने की सांद्रता और संबंधित Cq मान के अनुसार एक मानक वक्र बनाएं।मात्रात्मक विश्लेषण के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग करते समय, प्रवर्धन दक्षता 90%-110% (3.6>के>3.1) की सीमा में होनी आवश्यक है।
कम सांद्रता वाले नमूनों का पता लगाना
जब नमूना सांद्रता कम होती है, तो विभिन्न प्राइमर जांच की पहचान दरें भिन्न होती हैं।हम प्रतिकृति बनाने के लिए 20 कम-सांद्रता वाले नमूनों का चयन करते हैं, और उच्चतम पहचान दर वाला प्राइमर-जांच सिस्टम सबसे अच्छा है।
भिन्नता का गुणांक (सीवी)
न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन का पता लगाने के लिए अभिकर्मक के लाइन मानक के अनुसार विभिन्न प्राइमर जांच के साथ 10 डुप्लिकेट नमूनों का पता लगाया जा सकता है।
मात्रात्मक अभिकर्मक:
शुद्धता
एक बैच के भीतर सटीकता पूरी होनी चाहिए: परीक्षण एकाग्रता के लघुगणकीय मान का भिन्नता गुणांक (सीवी,%) ≤5% है।जब नमूना एकाग्रता कम होती है, तो पहचान एकाग्रता के लघुगणक का भिन्नता गुणांक (सीवी,%) ≤10% होता है
गुणात्मक अभिकर्मक:
शुद्धता
एक बैच के भीतर सटीकता मिलनी चाहिए:
(1) सीटी मान की भिन्नता का गुणांक (सीवी,%) ≤5%
एक ही नमूने का 10 बार समानांतर परीक्षण किया जाता है, और परीक्षण के परिणाम सुसंगत होने चाहिए
पोस्ट करने का समय: सितम्बर-18-2021
