मेरा मानना ​​है कि पीसीआर प्रतिक्रियाएं करते समय हर किसी को हमेशा ऐसी या ऐसी समस्याओं का सामना करना पड़ेगा, लेकिन उनमें से अधिकतर को दो मुख्य समस्याओं में वर्गीकृत किया जा सकता है:

जीन टेम्पलेट का बहुत कम प्रवर्धन (प्रवर्धन);
बहुत अधिक गैर-लक्ष्य जीन प्रवर्धन.
इन समस्याओं को हल करने के लिए एडिटिव्स का उपयोग आम रणनीतियों में से एक है।आमतौर पर एडिटिव्स की भूमिका के दो पहलू होते हैं:
द्वितीयक संरचनाजीन की (द्वितीयक संरचना);
गैर-विशिष्ट प्राइमिंग कम करें.
आज, संपादक आपको पीसीआर प्रतिक्रियाओं में सामान्य योजकों और उनके कार्यों से संक्षेप में परिचित कराएगा।
योजक जो द्वितीयक संरचना को कम करते हैं
सल्फ़ोक्साइड(डीएमएसओ)
जीन नमूनेउच्च जीसी सामग्री के साथ।हालाँकि, DMSO Taq पोलीमरेज़ गतिविधि को भी काफी कम कर देता है।इसलिए, सभी को टेम्पलेट पहुंच और पोलीमरेज़ की गतिविधि को संतुलित करना होगा।संपादक का सुझाव है कि आप अपने प्रयोग के अनुकूल एकाग्रता खोजने के लिए डीएसएमओ की विभिन्न सांद्रता, जैसे 2% से 10% तक, आज़मा सकते हैं।
गैर-आयनिक डिटर्जेंट
गैर-आयनिक डिटर्जेंट, जैसे 0.1-1% ट्राइटन एक्स-100, ट्वीन 20 या एनपी-40, आमतौर पर डीएनए माध्यमिक संरचना को कम करते हैं।यद्यपि यह टेम्पलेट जीन के प्रवर्धन को बढ़ा सकता है, लेकिन इससे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की परेशानी भी पैदा होगी।इसलिए, ये योजक बिना मलबे के कम उपज वाली पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन अपेक्षाकृत अशुद्ध पीआरसी प्रतिक्रियाओं के लिए इतनी अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं।गैर-आयनिक डिटर्जेंट का एक अन्य लाभ एसडीएस संदूषण में कमी है।आमतौर पर डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, एसडीएस को पीसीआर चरण में लाया जाएगा, जो पोलीमरेज़ की गतिविधि को काफी हद तक रोकता है।इसलिए, प्रतिक्रिया में 0.5% ट्वीन-20 या ट्वेन-40 जोड़ने से एसडीएस के नकारात्मक प्रभाव को बेअसर किया जा सकता है।
बीटेन_
बीटाइन द्वितीयक संरचना निर्माण को कम करके डीएनए प्रवर्धन में सुधार कर सकता है और आम तौर पर वाणिज्यिक पीसीआर किटों के लिए एक "रहस्यमय" जोड़ है।यदि आप बीटाइन का उपयोग करना चाहते हैं, तो आपको बीटाइन या बीटाइन मोनो-हाइड्रेट (बीटेन या बीटाइन मोनो-हाइड्रेट) डालना चाहिए, लेकिन बीटाइन हाइड्रोक्लोराइड (बीटेन एचसीएल) नहीं, 1-1.7M की अंतिम सांद्रता में समायोजित करें।बीटाइन विशिष्टता में सुधार करने में भी मदद कर सकता है क्योंकि यह डीएनए पिघलने/डीएनए विकृतीकरण की आधार जोड़ी संरचना निर्भरता को समाप्त करता है।
गैर-विशिष्ट प्राइमिंग को कम करने के लिए योजक
फॉर्मामाइड
फॉर्मामाइड आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला कार्बनिक पीसीआर एडिटिव है।यह डीएनए में प्रमुख खांचे और छोटे खांचे के साथ संयोजन कर सकता है, जिससे मास्टर डीएनए डबल हेलिक्स की स्थिरता कम हो जाती है और डीएनए के पिघलने का तापमान कम हो जाता है।पीसीआर प्रयोगों में प्रयुक्त फॉर्मामाइड की सांद्रता आमतौर पर 1%-5% होती है।
टेट्रामिथाइलअमोनियम क्लोराइड( टीएमएसी)
टेट्रामिथाइलमोनियम क्लोराइड संकरण की विशिष्टता (संकरण विशिष्टता) को बढ़ा सकता है और डीएनए के पिघलने के तापमान को बढ़ा सकता है।इस प्रकार, टीएमएसी गैर-विशिष्ट प्राइमिंग को हटा सकता है और डीएनए और आरएनए के गलत बंधन को कम कर सकता है।यदि तुम प्रयोग करते होपतित प्राइमरपीसीआर प्रतिक्रिया में, टीएमएसी जोड़ना याद रखें, जो आमतौर पर 15-100 मिमी की एकाग्रता पर उपयोग किया जाता है।
अन्य सामान्य योजक
ऊपर उल्लिखित एडिटिव्स की दो श्रेणियों के अलावा, पीसीआर प्रतिक्रियाओं में कई सामान्य एडिटिव्स हैं, हालांकि उनके अलग-अलग कार्य हैं, लेकिन वे बहुत महत्वपूर्ण भी हैं।
मैग्नीशियम आयन
मैग्नीशियम आयन पोलीमरेज़ का एक अनिवार्य सहकारक (कोफ़ेक्टर) है, यानी मैग्नीशियम आयन के बिना, पोलीमरेज़ निष्क्रिय है।हालाँकि, बहुत अधिक मैग्नीशियम आयन पोलीमरेज़ की दक्षता को भी प्रभावित कर सकते हैं।प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में मैग्नीशियम आयनों की सांद्रता अलग-अलग होगी।चेलेटिंग एजेंट (जैसे EDTA या साइट्रेट), dNTPs और प्रोटीन की सांद्रता सभी मैग्नीशियम आयनों की सांद्रता को प्रभावित करते हैं।इसलिए, यदि आपको अपने पीसीआर प्रयोग में समस्या है, तो आप विभिन्न मैग्नीशियम आयन सांद्रता को बदलने का प्रयास कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, 1.0 से 4.0 मिमी तक, बीच में 0.5-1 मिमी के अंतराल के साथ।
यह ध्यान देने योग्य है कि कई फ्रीज-पिघलना चक्र मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान के एकाग्रता स्तरीकरण को जन्म दे सकते हैं।इसलिए, आपको प्रत्येक उपयोग से पहले इसे पूरी तरह से घोलना चाहिए और उपयोग करने से पहले इसे अच्छी तरह से मिलाना चाहिए।
पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार(गोजातीय एल्बुमिन, बीएसए)
आणविक रसायन विज्ञान प्रयोगों में, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन एक बहुत ही सामान्य योजक है, विशेष रूप से प्रतिबंध एंजाइम पाचन और पीसीआर प्रयोगों में।पीसीआर प्रतिक्रियाओं में, बीएसए फेनोलिक यौगिकों जैसे दूषित पदार्थों को कम करने में सहायक है।और यह भी कहा जाता है कि यह टेस्ट ट्यूब की दीवार पर अभिकारकों के आसंजन को कम कर सकता है।पीसीआर प्रतिक्रिया में, आमतौर पर जोड़े गए बीएसए की सांद्रता 0.8 मिलीग्राम/एमएल तक पहुंच सकती है।
 
संबंधित उत्पाद:
पीसीआर हीरो(डाई के साथ)
पीसीआर हीरो