डायरेक्ट पीसीआर एक प्रतिक्रिया है जो न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के बिना प्रवर्धन के लिए सीधे जानवरों या पौधों के ऊतकों का उपयोग करती है।कई मायनों में, प्रत्यक्ष पीसीआर नियमित पीसीआर की तरह काम करता है

मुख्य अंतर प्रत्यक्ष पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले कस्टम बफर का है, नमूना सीधे न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के बिना पीसीआर प्रतिक्रिया के अधीन हो सकता है, लेकिन एंजाइमों की सहनशीलता और प्रत्यक्ष पीसीआर प्रतिक्रिया में शामिल बफर की संगतता के लिए संबंधित आवश्यकताएं हैं।

हालाँकि आम नमूनों में कम या ज्यादा पीसीआर अवरोधक होते हैं, फिर भी प्रत्यक्ष पीसीआर एंजाइम और बफ़र्स की कार्रवाई के तहत विश्वसनीय प्रवर्धन प्राप्त कर सकता है।पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड की आवश्यकता होती है, जो टेम्पलेट में प्रोटीन और अन्य अशुद्धियाँ होने पर पीसीआर प्रतिक्रिया की सुचारू प्रगति को रोक सकता है।डायरेक्ट पीसीआर वर्तमान में आणविक निदान के क्षेत्र में अधिक लोकप्रिय प्रौद्योगिकियों में से एक है।

01 डायरेक्ट पीसीआर मूल रूप से जानवरों और पौधों के लिए उपयोग किया जाता था

प्रत्यक्ष पीसीआर का सबसे पहला अनुप्रयोग जानवरों और पौधों के क्षेत्र में है, जैसे चूहे, बिल्ली, मुर्गी, खरगोश, भेड़, मवेशी आदि के रक्त, ऊतक और बाल, पौधों की पत्तियां और बीज आदि, जिनका उपयोग जीनोटाइपिंग, ट्रांसजेनिक, प्लास्मिड डिटेक्शन, जीन नॉकआउट विश्लेषण, डीएनए स्रोत पहचान, प्रजातियों की पहचान, एसएनपी विश्लेषण और अन्य क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

इन क्षेत्रों में कुछ सामान्य विशेषताएं हैं, अर्थात्, लक्ष्य जीन सामग्री अपेक्षाकृत अधिक है और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण परेशानी भरा है, इसलिए प्रत्यक्ष पीसीआर न केवल समय बचा सकता है और परिणामों पर थोड़ा प्रभाव डाल सकता है, बल्कि लागत भी बचा सकता है।

रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष पीसीआर का उपयोग हाल के वर्षों की बात है, कुछ पीसीआर अभिकर्मक निर्माताओं ने नवाचार करते समय इस दिशा में बहुत प्रयास किए हैं।विशेष रूप से इस COVID-19 महामारी में, कई ऐसे पहचान उत्पाद बाजार में सामने आए हैं, जैसे SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन किट (मल्टीप्लेक्स पीसीआर फ्लोरोसेंट जांच विधि) फोरजीन द्वारा अनुसंधान और विकसित किया गया है, जो मानव नासॉफिरिन्जियल या ऑरोफरीन्जियल स्वाब नमूनों में SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड के गुणात्मक पता लगाने के लिए वास्तविक समय आरटी पीसीआर तकनीक (आरआरटी-पीसीआर) का उपयोग करता है।

Foregene सामान्य ORF1ab, N, E, और का पता लगाने के लिए डायरेक्ट पीसीआर तकनीक का उपयोग करने वाली कंपनियों में से एक हैप्रकार मानव नासॉफिरिन्जियल या ऑरोफरीन्जियल स्वाब नमूनों में वंशावली न्यूक्लिक एसिड जैसे SARS-CoV-2 B.1.1.7 वंश (यूके), B.1.351 वंश (ZA), B.1.617 वंश (IND) और P.1 वंश (BR)।

02  प्रत्यक्ष पीसीआर के लिए आवश्यक अभिकर्मक

नमूना लाइसेट

नमूना लाइसेट को स्वयं कॉन्फ़िगर किया जा सकता है या खरीदा जा सकता है।लाइसेट के विभिन्न ब्रांडों की संरचना में अंतर से लाइसिंग क्षमता अलग हो जाएगी, और फिर लाइसिंग का समय थोड़ा अलग हो जाएगा।उदाहरण के लिए, जानवरों के ऊतकों के नमूनों की तैयारी के लिए, आम तौर पर 30 मिनट या रात भर के विश्लेषण की सिफारिश की जाती है, और वायरस के लिए विश्लेषण समाधान 3-10 मिनट तक होता है।

पीसीआर मास्टर मिक्स

विशिष्ट प्रवर्धन को बढ़ाने और प्रवर्धन क्षमता को बढ़ाने के लिए हॉट-स्टार्ट डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।प्रत्यक्ष पीसीआर का मूल एक अत्यधिक सहिष्णु पोलीमरेज़ है।

नमूने में डीएनए प्रवर्धन को प्रभावित करने वाले घटकों को हटा दें या रोक दें

नमूने को लाइसेट के साथ संसाधित करने के बाद, प्रोटीन, लिपिड और अन्य कोशिका अवशेष निकल जाएंगे, ये पदार्थ पीसीआर प्रतिक्रिया को रोक देंगे।इसलिए, प्रत्यक्ष पीसीआर को इन कारकों के प्रभाव को कम करने के लिए संबंधित निष्कासन या अवरोधकों को जोड़ने की आवश्यकता होती है।

03  प्रत्यक्ष पीसीआर के पांच ज्ञान बिंदुओं का संग्रह

पहला, डायरेक्ट पीसीआर तकनीक विभिन्न जैविक नमूनों के लिए एक प्रत्यक्ष पीसीआर तकनीक है।इस तकनीकी स्थिति के तहत, न्यूक्लिक एसिड को अलग करने और निकालने की कोई आवश्यकता नहीं है, सीधे ऊतक के नमूने को वस्तु के रूप में उपयोग करें, और पीसीआर प्रतिक्रिया करने के लिए लक्ष्य जीन प्राइमर जोड़ें।

दूसरा, डायरेक्ट पीसीआर तकनीक न केवल एक पारंपरिक डीएनए टेम्पलेट प्रवर्धन तकनीक है, बल्कि इसमें आरएनए टेम्पलेट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर भी शामिल है।

तीसरा, डायरेक्ट पीसीआर तकनीक न केवल सीधे ऊतक के नमूनों पर नियमित गुणात्मक पीसीआर प्रतिक्रियाएं करती है, बल्कि इसमें वास्तविक समय क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाएं भी शामिल होती हैं, जिसके लिए प्रतिक्रिया प्रणाली में मजबूत एंटी-बैकग्राउंड प्रतिदीप्ति हस्तक्षेप क्षमता और अंतर्जात प्रतिदीप्ति शमन करने वाली विरोधी क्षमता की आवश्यकता होती है।

चौथा, डायरेक्ट पीसीआर तकनीक द्वारा लक्षित नमूनों को केवल न्यूक्लिक एसिड टेम्प्लेट जारी करने की आवश्यकता होती है, और प्रोटीन, पॉलीसेकेराइड, नमक आयन आदि को नहीं हटाते हैं जो पीसीआर प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करते हैं।जटिल परिस्थितियों में एंजाइम गतिविधि और प्रतिकृति सटीकता सुनिश्चित करने के लिए उत्कृष्ट प्रतिरोध और अनुकूलनशीलता के लिए प्रतिक्रिया प्रणाली में न्यूक्लिक एसिड पोलीमरेज़ और पीसीआर मिक्स की आवश्यकता होती है।

पांचवां, बिना किसी न्यूक्लिक एसिड संवर्धन उपचार और टेम्पलेट की मात्रा के डायरेक्ट पीसीआर तकनीक द्वारा लक्षित ऊतक का नमूना बहुत छोटा है, जिसके लिए प्रतिक्रिया प्रणाली में अत्यधिक उच्च संवेदनशीलता और प्रवर्धन दक्षता की आवश्यकता होती है।