प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर (जिसे टाकमैन पीसीआर के रूप में भी जाना जाता है, जिसे इसके बाद एफक्यू-पीसीआर के रूप में जाना जाता है) 1995 में संयुक्त राज्य अमेरिका में पीई (पर्किन एल्मर) द्वारा विकसित एक नई न्यूक्लिक एसिड मात्रात्मक तकनीक है। यह तकनीक फ्लोरोसेंट लेबल जांच जोड़कर पारंपरिक पीसीआर पर आधारित है।लचीले पीसीआर की तुलना में, एफक्यू-पीसीआर के मात्रात्मक कार्य को साकार करने के कई फायदे हैं।इस लेख का उद्देश्य प्रौद्योगिकी की विशेषताओं, सिद्धांतों, विधियों और अनुप्रयोगों का संक्षेप में वर्णन करना है।

1 विशेषताएं

एफक्यू-पीसीआर में न केवल सामान्य पीसीआर की उच्च संवेदनशीलता है, बल्कि फ्लोरोसेंट जांच के अनुप्रयोग के कारण, यह मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए फोटोइलेक्ट्रिक चालन प्रणाली के माध्यम से पीसीआर प्रवर्धन के दौरान फ्लोरोसेंट सिग्नल के परिवर्तन का सीधे पता लगा सकता है, जो पारंपरिक पीसीआर की कई कमियों को दूर करता है, इसलिए इसमें डीएनए संकरण की उच्च विशिष्टता और स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक की उच्च सटीकता भी है।

उदाहरण के लिए, सामान्य पीसीआर उत्पादों को एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और एथिडियम ब्रोमाइड स्टेनिंग द्वारा पराबैंगनी प्रकाश के साथ या पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और सिल्वर स्टेनिंग द्वारा देखा जाना चाहिए।इसके लिए न केवल कई उपकरणों की आवश्यकता होती है, बल्कि समय और प्रयास भी लगता है।एथिडियम ब्रोमाइड का इस्तेमाल किया गया दाग मानव शरीर के लिए हानिकारक है, और ये जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं प्रदूषण और झूठी सकारात्मकता के अवसर प्रदान करती हैं।हालाँकि, नमूना लोडिंग के दौरान एफक्यू-पीसीआर को केवल एक बार ढक्कन खोलने की आवश्यकता होती है, और उसके बाद की प्रक्रिया पूरी तरह से बंद-ट्यूब ऑपरेशन होती है, जिसमें पीसीआर पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे पारंपरिक पीसीआर संचालन में कई कमियों से बचा जा सकता है।प्रयोग आम तौर पर पीई कंपनी द्वारा विकसित ABI7100 पीसीआर थर्मल साइक्लर का उपयोग करता है।

उपकरण में निम्नलिखित विशेषताएं हैं: ① व्यापक अनुप्रयोग: इसका उपयोग डीएनए और आरएनए पीसीआर उत्पाद मात्रा निर्धारण, जीन अभिव्यक्ति अनुसंधान, रोगज़नक़ का पता लगाने और पीसीआर स्थितियों के अनुकूलन के लिए किया जा सकता है।② अद्वितीय मात्रात्मक सिद्धांत: फ्लोरोसेंटली लेबल जांच का उपयोग करके, लेजर उत्तेजना के बाद पीसीआर चक्र के साथ प्रतिदीप्ति की मात्रा जमा हो जाएगी, ताकि परिमाणीकरण के उद्देश्य को प्राप्त किया जा सके।③ उच्च कार्यकुशलता: अंतर्निहित 9600 पीसीआर थर्मल साइक्लर, 96 नमूनों के प्रवर्धन और परिमाणीकरण को स्वचालित रूप से और समकालिक रूप से पूरा करने के लिए कंप्यूटर 1 से 2 घंटे तक नियंत्रित होता है।④ जेल वैद्युतकणसंचलन की कोई आवश्यकता नहीं: नमूने को पतला और वैद्युतकणसंचलन करने की कोई आवश्यकता नहीं है, सीधे प्रतिक्रिया ट्यूब में पता लगाने के लिए एक विशेष जांच का उपयोग करें।⑤पाइपलाइन में कोई प्रदूषण नहीं: अद्वितीय पूरी तरह से संलग्न प्रतिक्रिया ट्यूब और फोटोइलेक्ट्रिक संचालन प्रणाली को अपनाया जाता है, इसलिए प्रदूषण के बारे में चिंता करने की कोई आवश्यकता नहीं है।⑥परिणाम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं: मात्रात्मक गतिशील सीमा परिमाण के पांच आदेशों तक है।इसलिए, चूंकि यह तकनीक सफलतापूर्वक विकसित की गई थी, इसलिए इसे कई वैज्ञानिक शोधकर्ताओं द्वारा महत्व दिया गया है और इसे कई क्षेत्रों में लागू किया गया है।

2 सिद्धांत और विधियाँ

एफक्यू-पीसीआर का कार्य सिद्धांत पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में एक फ्लोरोसेंटली लेबल जांच जोड़ने के लिए टैक एंजाइम की 5'→3' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि का उपयोग करना है।जांच विशेष रूप से प्राइमर अनुक्रम में निहित डीएनए टेम्पलेट के साथ संकरण कर सकती है।जांच के 5′अंत को प्रतिदीप्ति उत्सर्जन जीन FAM (6-कार्बोक्सीफ्लुओरेसिन, 518nm पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन शिखर) के साथ लेबल किया गया है, और 3′अंत को प्रतिदीप्ति शमन समूह TAMRA (6-कार्बोक्सिटेट्रामिथाइलरोडामाइन, 582nm पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन शिखर) के साथ लेबल किया गया है, जांच के 3′प्रारंभ को जांच को आगे बढ़ने से रोकने के लिए फॉस्फोराइलेट किया गया है। पीसीआर प्रवर्धन के दौरान.जब जांच बरकरार रहती है, तो क्वेंचर समूह उत्सर्जक समूह के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को दबा देता है।एक बार जब उत्सर्जक समूह शमन समूह से अलग हो जाता है, तो अवरोध हटा दिया जाता है, और 518nm पर ऑप्टिकल घनत्व बढ़ जाता है और प्रतिदीप्ति पहचान प्रणाली द्वारा इसका पता लगाया जाता है। पुनर्नवा चरण में, जांच टेम्पलेट डीएनए के साथ संकरण करती है, और विस्तार चरण में टैक एंजाइम प्राइमर के विस्तार के साथ डीएनए टेम्पलेट के साथ चलता है।जब जांच काट दी जाती है, तो शमन प्रभाव जारी होता है और फ्लोरोसेंट सिग्नल जारी होता है।हर बार जब टेम्पलेट की प्रतिलिपि बनाई जाती है, तो एक फ्लोरोसेंट सिग्नल जारी होने के साथ, एक जांच काट दी जाती है।चूंकि जारी फ़्लोरोफ़ोर्स की संख्या और पीसीआर उत्पादों की संख्या के बीच एक-से-एक संबंध है, इसलिए इस तकनीक का उपयोग टेम्पलेट को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।प्रायोगिक उपकरण आम तौर पर पीई कंपनी द्वारा विकसित ABI7100 पीसीआर थर्मल साइक्लर का उपयोग करता है, और अन्य थर्मल साइक्लर का भी उपयोग किया जा सकता है।यदि प्रयोग के लिए ABI7700 प्रतिक्रिया प्रकार प्रतिक्रिया प्रणाली का उपयोग किया जाता है, तो प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, मात्रात्मक परिणाम सीधे कंप्यूटर विश्लेषण के माध्यम से दिए जा सकते हैं।यदि आप अन्य थर्मल साइक्लर्स का उपयोग करते हैं, तो आपको RQ+, RQ-, △RQ की गणना करने के लिए एक ही समय में प्रतिक्रिया ट्यूब में प्रतिदीप्ति संकेत को मापने के लिए एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर का उपयोग करने की आवश्यकता है।आरक्यू+ नमूना ट्यूब के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन समूह की ल्यूमिनेसेंस तीव्रता और शमन समूह की ल्यूमिनेसेंस तीव्रता के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है, आरक्यू- खाली ट्यूब में दोनों के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) पीसीआर के दौरान फ्लोरोसेंस सिग्नल परिवर्तन की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है डेटा प्रोसेसिंग के बाद, मात्रात्मक परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।फ्लोरोसेंट जांच की शुरूआत के कारण, प्रयोग की विशिष्टता में काफी सुधार हुआ है।जांच डिज़ाइन को आम तौर पर निम्नलिखित शर्तों को पूरा करना चाहिए: ① बाइंडिंग की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए जांच की लंबाई लगभग 20-40 आधार होनी चाहिए।②एकल न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के दोहराव से बचने के लिए जीसी आधारों की सामग्री 40% और 60% के बीच है।③ प्राइमरों के साथ संकरण या ओवरलैप से बचें।④ जांच और टेम्पलेट के बीच बाइंडिंग की स्थिरता प्राइमर और टेम्पलेट के बीच बाइंडिंग की स्थिरता से अधिक है, इसलिए जांच का टीएम मान प्राइमर के टीएम मान से कम से कम 5 डिग्री सेल्सियस अधिक होना चाहिए।इसके अलावा, जांच की एकाग्रता, जांच और टेम्पलेट अनुक्रम के बीच समरूपता, और जांच और प्राइमर के बीच की दूरी सभी का प्रयोगात्मक परिणामों पर प्रभाव पड़ता है।

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