रियल टाइम पीसीआर, जिसे मात्रात्मक पीसीआर या क्यूपीसीआर के रूप में भी जाना जाता है, पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों की वास्तविक समय की निगरानी और विश्लेषण के लिए एक विधि है।
क्योंकि मात्रात्मक पीसीआर में सरल संचालन, तेज और सुविधाजनक, उच्च संवेदनशीलता, अच्छी पुनरावृत्ति और कम संदूषण दर के फायदे हैं, इसका व्यापक रूप से चिकित्सा परीक्षण, दवा प्रभावकारिता मूल्यांकन, जीन अभिव्यक्ति अनुसंधान, ट्रांसजेनिक अनुसंधान, जीन का पता लगाने, रोगज़नक़ का पता लगाने, पशु और पौधे का पता लगाने में उपयोग किया जाता है।, खाद्य परीक्षण और अन्य क्षेत्र।
इसलिए, चाहे आप जीवन विज्ञान में बुनियादी अनुसंधान में लगे हों, या फार्मास्युटिकल कंपनियों, पशुपालन कंपनियों, खाद्य कंपनियों के कर्मचारी हों, या यहां तक ​​कि प्रवेश-निकास निरीक्षण और संगरोध ब्यूरो, पर्यावरण निगरानी विभागों, अस्पतालों और अन्य इकाइयों के कर्मचारी हों, आप कमोबेश इससे अवगत होंगे या आपको मात्रात्मक पीसीआर में महारत हासिल करने के ज्ञान को जानने की जरूरत है।

रियल टाइम पीसीआर का सिद्धांत

रियल टाइम पीसीआर एक ऐसी विधि है जिसमें फ्लोरोसेंट पदार्थों को पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में जोड़ा जाता है, और पीसीआर प्रतिक्रिया की प्रक्रिया में फ्लोरोसेंस सिग्नल की तीव्रता की वास्तविक समय में मात्रात्मक पीसीआर उपकरण द्वारा निगरानी की जाती है, और अंत में प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण और संसाधित किया जाता है।

【प्रवर्धन वक्र】पीसीआर की गतिशील प्रक्रिया का वर्णन करने वाला वक्र है।पीसीआर का प्रवर्धन वक्र वास्तव में एक मानक घातीय वक्र नहीं है, बल्कि एक सिग्मॉइड वक्र है।

[प्रवर्धन वक्र का मंच चरण]पीसीआर चक्रों की संख्या में वृद्धि, डीएनए पोलीमरेज़ की निष्क्रियता, डीएनटीपी और प्राइमरों की कमी, और प्रतिक्रिया उपोत्पाद पाइरोफॉस्फेट आदि द्वारा संश्लेषण प्रतिक्रिया के अवरोध के साथ, पीसीआर हमेशा तेजी से विस्तार नहीं करता है।, और अंततः एक पठार में प्रवेश करेगा।

[प्रवर्धन वक्र का घातीय वृद्धि क्षेत्र]यद्यपि पठारी चरण बहुत भिन्न होता है, प्रवर्धन वक्र के घातीय वृद्धि क्षेत्र के एक निश्चित क्षेत्र में, दोहराव बहुत अच्छा होता है, जो पीसीआर के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

[सीमा मूल्य और सीटी मूल्य]हम प्रवर्धन वक्र के घातीय वृद्धि क्षेत्र में उचित स्थान पर प्रतिदीप्ति पहचान का सीमा मान निर्धारित करते हैं, अर्थात् थ्रेशोल्ड मान (थ्रेसहोल्ड)।थ्रेशोल्ड मान और प्रवर्धन वक्र का प्रतिच्छेदन सीटी मान है, अर्थात, थ्रेशोल्ड मान तक पहुंचने पर सीटी मान चक्रों की संख्या (थ्रेसहोल्ड चक्र) को संदर्भित करता है।

नीचे दिया गया ग्राफ स्पष्ट रूप से थ्रेशोल्ड लाइन और प्रवर्धन वक्र, थ्रेशोल्ड और सीटी मान के बीच संबंध दिखाता है।

【मात्रा कैसे निर्धारित करें?】

गणितीय सिद्धांत द्वारा यह सिद्ध किया गया है कि Ct मान का प्रारंभिक टेम्पलेट्स की संख्या के लघुगणक के साथ व्युत्क्रम रैखिक संबंध है।रियल टाइम पीसीआर वास्तविक समय में पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों की निगरानी करता है और घातीय प्रवर्धन चरण के दौरान उनकी मात्रा निर्धारित करता है।

पीसीआर के प्रत्येक चक्र के लिए, डीएनए तेजी से 2 गुना बढ़ गया, और जल्द ही एक पठार पर पहुंच गया।

यह मानते हुए कि आरंभिक डीएनए की मात्रा A है₀ , n चक्रों के बाद, डीएनए उत्पाद की सैद्धांतिक मात्रा को इस प्रकार व्यक्त किया जा सकता है:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

फिर, प्रारंभिक डीएनए मात्रा A 0 जितनी अधिक होगी, प्रवर्धित उत्पाद की मात्रा उतनी ही जल्दी पता लगाने वाले मान An तक पहुंच जाएगी, और An तक पहुंचने पर चक्रों की संख्या सीटी मान होगी।अर्थात्, प्रारंभिक डीएनए मात्रा A 0 जितनी अधिक होगी, प्रवर्धन वक्र उतनी ही जल्दी चरम पर होगा, और तदनुसार चक्रों की आवश्यक संख्या n छोटी होगी।

हम ज्ञात एकाग्रता के मानक को क्रमिक रूप से कमजोर करते हैं और इसे रियल टाइम पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हैं, और डीएनए मात्रा को अधिक से कम शुरू करने के क्रम में समान अंतराल पर प्रवर्धन वक्रों की एक श्रृंखला प्राप्त की जाएगी।सीटी मान और प्रारंभिक टेम्पलेट्स की संख्या के लघुगणक के बीच रैखिक संबंध के अनुसार, ए[मानक वक्र] बनाया जा सकता है।

अज्ञात सांद्रता वाले नमूने के सीटी मान को मानक वक्र में प्रतिस्थापित करके, अज्ञात सांद्रता वाले नमूने की प्रारंभिक टेम्पलेट मात्रा प्राप्त की जा सकती है, जो वास्तविक समय पीसीआर का मात्रात्मक सिद्धांत है।

रियल टाइम पीसीआर का पता लगाने की विधि

रियल टाइम पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाकर पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों का पता लगाता है।

फ्लोरोसेंट डाई एम्बेडिंग विधि का सिद्धांत】

फ्लोरोसेंट रंग, जैसे कि टीबी ग्रीन®, पीसीआर सिस्टम में डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए से विशिष्ट रूप से बंध सकता है और बंधने पर प्रतिदीप्त हो सकता है।

पीसीआर चक्रों की वृद्धि के साथ प्रतिक्रिया प्रणाली में प्रतिदीप्ति तीव्रता तेजी से बढ़ी।प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाकर, प्रतिक्रिया प्रणाली में डीएनए प्रवर्धन की मात्रा की वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, और फिर नमूने में शुरुआती टेम्पलेट की मात्रा का रिवर्स अनुमान लगाया जा सकता है।

【फ्लोरोसेंट जांच विधि का सिद्धांत】

फ्लोरोसेंट जांच5′ सिरे पर एक फ्लोरोसेंट समूह और 3′ सिरे पर एक शमन समूह के साथ एक न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम है, जो विशेष रूप से टेम्पलेट से बंध सकता है।जब जांच बरकरार रहती है, तो फ्लोरोफोर द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति शमन समूह द्वारा बुझ जाती है और प्रतिदीप्ति नहीं कर पाती है।जब जांच विघटित हो जाती है, तो फ्लोरोसेंट पदार्थ अलग हो जाएगा और प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करेगा।

पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान में एक फ्लोरोसेंट जांच जोड़ा जाता है।एनीलिंग प्रक्रिया के दौरान, फ्लोरोसेंट जांच टेम्पलेट की विशिष्ट स्थिति से जुड़ जाएगी।विस्तार प्रक्रिया के दौरान, पीसीआर एंजाइम की 5'→3' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि टेम्पलेट के साथ संकरणित फ्लोरोसेंट जांच को विघटित कर सकती है, और फ्लोरोसेंट पदार्थ प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने के लिए अलग हो जाता है।प्रतिक्रिया प्रणाली में जांच की प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाकर, पीसीआर उत्पाद की प्रवर्धन मात्रा की निगरानी के उद्देश्य को प्राप्त किया जा सकता है।

【प्रतिदीप्ति जांच विधि का चयन】

यदि इसका उपयोग उच्च होमोलॉजी के साथ अनुक्रमों को अलग करने और एसएनपी टाइपिंग विश्लेषण जैसे मल्टीप्लेक्स पीसीआर डिटेक्शन करने के लिए किया जाता है, तो फ्लोरोसेंट जांच विधि अपूरणीय है।
अन्य रियल टाइम पीसीआर प्रयोगों के लिए, एक सरल, आसान और कम लागत वाली फ्लोरोसेंट चिमेरा विधि का उपयोग किया जा सकता है।

जांचमजबूत विशिष्टता, मल्टीप्लेक्स पीसीआर में सक्षम

कमी

प्रवर्धन के लिए उच्च विशिष्टता आवश्यकताएँ;

मल्टीप्लेक्स पीसीआर का प्रदर्शन नहीं किया जा सकता, विशिष्ट जांच डिजाइन करने की आवश्यकता, उच्च लागत;

कभी-कभी जांच डिज़ाइन कठिन होता है

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