पीसीआर सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन तकनीक है और इसकी संवेदनशीलता और विशिष्टता के कारण इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।हालाँकि, पीसीआर को बार-बार थर्मल विकृतीकरण की आवश्यकता होती है और उपकरणों और उपकरणों पर निर्भर रहने की सीमाओं से छुटकारा नहीं मिल सकता है, जो नैदानिक क्षेत्र परीक्षण में इसके अनुप्रयोग को सीमित करता है।
1990 के दशक की शुरुआत से, कई प्रयोगशालाओं ने निरंतर तापमान प्रवर्धन तकनीक विकसित करना शुरू कर दिया है जिसके लिए थर्मल विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं होती है।अब उन्होंने लूप-मध्यस्थ इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन तकनीक, स्ट्रैंड रिप्लेसमेंट इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन तकनीक, रोलिंग सर्कल इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन तकनीक और न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम निर्भरता विकसित की है।इज़ोटेर्माल प्रवर्धन प्रौद्योगिकी और अन्य प्रौद्योगिकियाँ।
Lऊप-मध्यस्थता इज़ोटेर्मल प्रवर्धन
प्रवर्धन सिद्धांत इस तथ्य पर आधारित है कि डीएनए लगभग 65°C पर गतिशील संतुलन स्थिति में है।जब किसी प्राइमर को बेस-पेयर किया जाता है और डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के पूरक भाग तक बढ़ाया जाता है, तो दूसरा स्ट्रैंड अलग हो जाएगा और सिंगल-स्ट्रैंडेड बन जाएगा।
इस तापमान पर, डीएनए स्ट्रैंड-विस्थापन डीएनए के संश्लेषण को लगातार स्व-परिचालित करने के लिए स्ट्रैंड-विस्थापन डीएनए पोलीमरेज़ पर भरोसा करने के लिए 4 विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करता है।
पहले लक्ष्य जीन पर 6 विशिष्ट क्षेत्र F3, F2, F1, B1, B2, B3 निर्धारित करें, और फिर इन 6 विशिष्ट क्षेत्रों के आधार पर 4 प्राइमर डिज़ाइन करें (जैसा कि नीचे दिए गए चित्र में दिखाया गया है):
फॉरवर्ड इनर प्राइमर (FIP) F1c और F2 से बना है।
बैकवर्ड इनर प्राइमर (बीआईपी) बी1सी और बी2 से बना है, और टीटीटीटी का उपयोग बीच में स्पेसर के रूप में किया जाता है।
बाहरी प्राइमर F3 और B3 क्रमशः लक्ष्य जीन पर F3 और B3 क्षेत्रों से बने होते हैं।
LAMP प्रतिक्रिया प्रणाली में, आंतरिक प्राइमर की सांद्रता बाहरी प्राइमर की तुलना में कई गुना अधिक होती है।डीएनए डबल स्ट्रैंड बनाने के लिए एक पूरक स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए आंतरिक प्राइमर को पहले टेम्पलेट स्ट्रैंड के साथ जोड़ा जाता है।इसके बाद, डीएनए डबल स्ट्रैंड बनाने के लिए बाहरी प्राइमर को टेम्पलेट स्ट्रैंड के साथ जोड़ा जाता है।BstDNA पोलीमरेज़ की कार्रवाई के तहत, आंतरिक प्राइमर द्वारा संश्लेषित पूरक स्ट्रैंड जारी किया जाता है।प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के बाद, पूरक स्ट्रैंड अंततः डम्बल संरचना के साथ एक एकल डीएनए स्ट्रैंड बनाता है।
डम्बल संरचना डीएनए सिंगल स्ट्रैंड का उपयोग एक खुले सिरे के साथ एक संक्रमणकालीन स्टेम-लूप संरचना डीएनए को लगातार बनाने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जाता है।आंतरिक और बाहरी प्राइमर संक्रमणकालीन स्टेम-लूप संरचना डीएनए को लगातार स्ट्रैंड विस्थापन और विस्तार प्रतिक्रियाओं से गुजरने के लिए निर्देशित करते हैं, और अंत में विभिन्न लंबाई के साथ कई स्टेम-लूप संरचनाएं बनाते हैं।डीएनए मिश्रण.
लूप-मध्यस्थ इज़ोटेर्मल प्रवर्धन के फायदे और नुकसान
लैंप के लाभ:
(1) उच्च प्रवर्धन दक्षता, जो 1 घंटे के भीतर लक्ष्य जीन की 1-10 प्रतियों को प्रभावी ढंग से बढ़ा सकती है, और प्रवर्धन दक्षता सामान्य पीसीआर की 10-100 गुना है।
(2) प्रतिक्रिया समय कम है, विशिष्टता मजबूत है, और किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है।
लैंप की कमियाँ:
(1) प्राइमर की आवश्यकताएँ विशेष रूप से अधिक हैं।
(2) प्रवर्धित उत्पाद का उपयोग क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए नहीं किया जा सकता है, बल्कि इसका उपयोग केवल निर्णय के लिए किया जा सकता है।
(3) इसकी मजबूत संवेदनशीलता के कारण, एरोसोल बनाना आसान है, जिससे गलत सकारात्मक परिणाम आते हैं और परीक्षण के परिणाम प्रभावित होते हैं।
Sट्रांड विस्थापन प्रवर्धन
स्ट्रैंड विस्थापन प्रवर्धन (एसडीए) एक इन विट्रो इज़ोटेर्मल डीएनए प्रवर्धन तकनीक है जो पहली बार 1992 में अमेरिकी विद्वान वॉकर द्वारा प्रस्तावित एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया पर आधारित है।
एसडीए की मूल प्रणाली में प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़, स्ट्रैंड विस्थापन गतिविधि के साथ एक डीएनए पोलीमरेज़, प्राइमर के दो जोड़े, डीएनटीपी, और कैल्शियम और मैग्नीशियम आयन और बफर सिस्टम शामिल हैं।
स्ट्रैंड विस्थापन प्रवर्धन का सिद्धांत लक्ष्य डीएनए के दोनों सिरों पर रासायनिक रूप से संशोधित प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ मान्यता अनुक्रम पर आधारित है।एंडोन्यूक्लिज़ अपने पहचान स्थल पर स्ट्रैंड डीएनए में अंतर को खोलता है, और डीएनए पोलीमरेज़ अंतर 3′ अंत तक बढ़ाता है और अगले डीएनए स्ट्रैंड को प्रतिस्थापित करता है।
डीएनए के प्रतिस्थापित एकल स्ट्रैंड को प्राइमर के साथ जोड़ा जा सकता है और डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा डबल स्ट्रैंड में विस्तारित किया जा सकता है।इस प्रक्रिया को लगातार दोहराया जाता है, ताकि लक्ष्य अनुक्रम को कुशलतापूर्वक बढ़ाया जा सके।
स्ट्रैंड विस्थापन प्रवर्धन प्रौद्योगिकी के फायदे और नुकसान
एसडीए के लाभ:
प्रवर्धन दक्षता अधिक है, प्रतिक्रिया समय कम है, विशिष्टता मजबूत है, और किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है।
एसडीए की कमियाँ:
उत्पाद एक समान नहीं होते हैं, और कुछ सिंगल-स्ट्रैंडेड और डबल-स्ट्रैंडेड उत्पाद हमेशा एसडीए चक्र में उत्पादित होते हैं, और इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पता लगाए जाने पर टेलिंग अनिवार्य रूप से घटित होगी।
Rऑलिंग सर्कल प्रवर्धन
रोलिंग सर्कल एम्प्लीफिकेशन (आरसीए) को रोलिंग सर्कल द्वारा रोगजनक जीवों से डीएनए की प्रतिलिपि बनाने की विधि पर आधारित प्रस्तावित किया गया है।यह लक्ष्य जीन के प्रवर्धन को प्राप्त करने के लिए रोलिंग सर्कल डीएनए संश्लेषण की क्रिया के तहत एक स्थिर तापमान पर एक टेम्पलेट के रूप में एकल-फंसे परिपत्र डीएनए और एक विशेष डीएनए पोलीमरेज़ (जैसे Phi29)) के उपयोग को संदर्भित करता है।
आरसीए को रैखिक प्रवर्धन और घातीय प्रवर्धन में विभाजित किया जा सकता है।रैखिक आरसीए की दक्षता 10 तक पहुंच सकती है5समय, और घातीय आरसीए की दक्षता 10 तक पहुंच सकती है9बार.
सरल अंतर, जैसा कि नीचे दिए गए चित्र में दिखाया गया है, रैखिक प्रवर्धन ए केवल 1 प्राइमर का उपयोग करता है, घातीय प्रवर्धन बी में 2 प्राइमर हैं।
लीनियर आरसीए को सिंगल प्राइमर आरसीए भी कहा जाता है।एक प्राइमर गोलाकार डीएनए से जुड़ता है और डीएनए पोलीमरेज़ की क्रिया द्वारा बढ़ाया जाता है।उत्पाद एक रैखिक एकल स्ट्रैंड है जिसमें एकल लूप की लंबाई से हजारों गुना अधिक दोहराव वाले अनुक्रम होते हैं।
चूंकि रैखिक आरसीए का उत्पाद हमेशा शुरुआती प्राइमर से जुड़ा होता है, सिग्नल का आसान निर्धारण एक प्रमुख लाभ है।
एक्सपोनेंशियल आरसीए, जिसे हाइपर ब्रांच्ड एम्प्लीफिकेशन एचआरसीए (हाइपर ब्रांच्ड आरसीए) के रूप में भी जाना जाता है, एक्सपोनेंशियल आरसीए में, एक प्राइमर आरसीए उत्पाद को बढ़ाता है, दूसरा प्राइमर आरसीए उत्पाद के साथ संकरण करता है और फैलता है, और प्रतिस्थापन पहले से ही आरसीए उत्पाद से जुड़ा होता है। डाउनस्ट्रीम प्राइमर स्ट्रैंड का विस्तार करते हैं, और एक डेंड्राइटिक आरसीए प्रवर्धन उत्पाद का उत्पादन करने के लिए विस्तार और प्रतिस्थापन को दोहराते हैं।
रोलिंग सर्कल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन के फायदे और नुकसान
आरसीए के लाभ:
उच्च संवेदनशीलता, अच्छी विशिष्टता और आसान संचालन।
आरसीए की कमियाँ:
सिग्नल का पता लगाने के दौरान पृष्ठभूमि की समस्याएं।आरसीए प्रतिक्रिया के दौरान, अनियंत्रित पैडलॉक जांच और अनबाउंड जांच के टेम्पलेट डीएनए या आरएनए कुछ पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न कर सकते हैं।
Nयूक्लिकेसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन
न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन (NASBA) पीसीआर के आधार पर विकसित एक नई तकनीक है।यह एक सतत और इज़ोटेर्माल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन है जो T7 प्रमोटर अनुक्रम के साथ प्राइमरों की एक जोड़ी द्वारा निर्देशित होता है।यह तकनीक टेम्पलेट आरएनए को लगभग 2 घंटे में लगभग 109 गुना तक बढ़ा सकती है, जो पारंपरिक पीसीआर विधि से 1000 गुना अधिक है और इसके लिए विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है।
इस तकनीक का उपयोग सामने आते ही रोगों के त्वरित निदान के लिए किया जाने लगा है और वर्तमान में कई कंपनियां आरएनए डिटेक्शन किट में इस पद्धति का उपयोग करती हैं।
यद्यपि आरएनए प्रवर्धन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर तकनीक का भी उपयोग कर सकता है, NASBA के अपने फायदे हैं: इसे अपेक्षाकृत स्थिर तापमान स्थितियों के तहत किया जा सकता है, और यह पारंपरिक पीसीआर तकनीक की तुलना में अधिक स्थिर और सटीक है।
प्रतिक्रिया 41 डिग्री सेल्सियस पर होती है और इसे पूरा करने के लिए AMV (एवियन मायलोब्लास्टोसिस वायरस) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, RNase H, T7 RNA पोलीमरेज़ और प्राइमर की एक जोड़ी की आवश्यकता होती है।
इस प्रक्रिया में मुख्य रूप से शामिल हैं:
फॉरवर्ड प्राइमर में T7 प्रमोटर का पूरक अनुक्रम शामिल है।प्रतिक्रिया के दौरान, आगे का प्राइमर आरएनए स्ट्रैंड से जुड़ जाता है और डीएनए-आरएनए डबल स्ट्रैंड बनाने के लिए एएमवी एंजाइम द्वारा उत्प्रेरित होता है।
RNase H हाइब्रिड डबल-स्ट्रैंड में RNA को पचाता है और सिंगल-स्ट्रैंडेड DNA को बनाए रखता है।
रिवर्स प्राइमर और एएमवी एंजाइम की कार्रवाई के तहत, टी7 प्रमोटर अनुक्रम वाला एक डीएनए डबल स्ट्रैंड बनता है।
टी7 आरएनए पोलीमरेज़ की कार्रवाई के तहत, प्रतिलेखन प्रक्रिया पूरी हो जाती है और बड़ी मात्रा में लक्ष्य आरएनए का उत्पादन होता है।
NASBA के लाभ:
(1) इसके प्राइमर में T7 प्रमोटर अनुक्रम है, लेकिन विदेशी डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए में कोई T7 प्रमोटर अनुक्रम नहीं है और इसे प्रवर्धित नहीं किया जा सकता है, इसलिए इस तकनीक में उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता है।
(2) NASBA सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया को प्रवर्धन प्रतिक्रिया में शामिल करता है, जिससे प्रतिक्रिया समय कम हो जाता है।
NASBA के नुकसान:
(1) प्रतिक्रिया घटक अधिक जटिल हैं।
(2) प्रतिक्रिया लागत को अधिक बनाने के लिए तीन प्रकार के एंजाइमों की आवश्यकता होती है।
पोस्ट करने का समय: अगस्त-06-2021
