आरटी-क्यूपीसीआर आण्विक जीवविज्ञान का मूल प्रयोग है, और हर किसी को इससे परिचित होना चाहिए।इसमें मुख्य रूप से तीन चरण शामिल हैं: आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर।इससे कोई मदद नहीं मिलती, क्या हो रहा है?संभावना है कि इसमें कोई समस्या हैरिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्रयोग!हालाँकि ऐसा लगता है कि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रयोग में केवल आरएनए, डीएनटीपी, प्राइमर और जोड़ने की जरूरत हैरिवर्स ट्रांसक्रिपटेससेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें और अच्छी तरह मिलाएँ, लेकिन वास्तविक संचालन प्रक्रिया में, अभी भी कई विवरण हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है।आइए जानें इसके बारे में!

आरएनए की गुणवत्ता का निर्धारण कैसे करें?
सीडीएनए प्राप्त करने के लिए, आरएनए की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है!आरएनए गुणवत्ता का पता मुख्य रूप से दो पहलुओं से लगाया जा सकता है:
(1) आरएनए अखंडता:आरएनए अखंडता को एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. यूकेरियोट्स को एक उदाहरण के रूप में लेते हुए, पूर्ण कुल आरएनए में तीन स्पष्ट बैंड होते हैं, बड़े से छोटे तक आणविक भार 28S, 18S और 5S होते हैं, और 28S 18S से दोगुना चमकीला होता है;यदि तीन बैंड देखे जा सकते हैं, लेकिन बैंड का प्रकार धुंधला है या प्रसार का मतलब है कि आरएनए आंशिक रूप से क्षीण हो गया है।इस समय, कृपया तुरंत रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करें और टेम्पलेट इनपुट को उचित रूप से बढ़ाएं;यदि केवल छोटे आणविक भार वाला एक बैंड या कोई बैंड नहीं देखा जा सकता है, तो आरएनए पूरी तरह से नष्ट हो गया है और इसे फिर से निकालने की आवश्यकता है।एगिलेंट 2100 पीक आरेख और आरआईएन मूल्य के साथ आरएनए की अखंडता को इंगित करता है।यदि न्यूक्लिक एसिड बरकरार है, तो इलेक्ट्रोफेरोग्राम की आधार रेखा समतल है;यदि न्यूक्लिक एसिड गंभीर रूप से क्षीण हो जाता है, तो आधार रेखा असमान होती है और अधिक क्षरण शिखर दिखाई देते हैं;RIN का मान 0-10 की सीमा के भीतर, RNA की अखंडता को दर्शाता है, मान जितना बड़ा होगा, RNA की गुणवत्ता उतनी ही बेहतर होगी।खैर, पूर्णता की डिग्री जितनी अधिक होगी।
(2) आरएनए की शुद्धता:यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा OD260/280 के अनुपात का पता लगाया जा सकता है।यदि OD260/280 का अनुपात 1.9 और 2.1 के बीच है, तो शुद्धता बहुत अच्छी है।
अवशिष्ट जीनोमिक डीएनए गलत मात्रात्मक परिणाम दे सकता है
जब आरएनए निकाला जाता है, तो जो आरएनए हमें मिलता है वह जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) के साथ मिश्रित हो सकता है जिसे साफ नहीं किया गया है।इसलिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद सीडीएनए को भी मिलाया जाएगाजीडीएनए.डाउनस्ट्रीम के दौरानक्यूपीसीआरप्रतिक्रिया,सीडीएनएऔर जीडीएनए को एक साथ बढ़ाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत छोटा सीटी मान होता है, इसलिए परिणाम पक्षपाती हो सकते हैं।
तो इस स्थिति में हमें क्या करना चाहिए?फोरजीनसुझाव:
(1) उल्टे आरएनए पर जीनोम की सफाई करें, जिसे आरएनए निष्कर्षण के दौरान स्तंभ निष्कर्षण द्वारा हटाया जा सकता है;
(2) निकाले गए आरएनए को DNase से उपचारित करेंI , लेकिन इसे EDTA के साथ समाप्त करें;
रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन अभिकर्मकों कीजीनोम समाशोधन मॉड्यूल के साथ;

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए प्राइमर कैसे चुनें?
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के परिणाम को भी प्रभावित करते हैं।आप प्रयोग की विशिष्ट परिस्थितियों के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए यादृच्छिक प्राइमर, ओलिगो डीटी या जीन-विशिष्ट प्राइमर चुन सकते हैं:
(1) विशिष्ट प्रतिलेख: जीन-विशिष्ट प्राइमरों की अनुशंसा की जाती है;
(2) लंबे खंड प्रतिलेख: ओलिगो डीटी/जीन-विशिष्ट प्राइमरों की अनुशंसा की जाती है;
(3) लंबे खंड वाले प्रतिलेखों के आंतरिक टुकड़े: जीन-विशिष्ट प्राइमर/यादृच्छिक प्राइमर/यादृच्छिक प्राइमर + ओलिगो डीटी।यदि अगला क्यूपीसीआर प्रयोग किया जाता है, तो ओलिगो डीटी का अकेले उपयोग नहीं किया जा सकता है, क्योंकि अकेले ओलिगो डीटी का उपयोग करने से 3′ अंत पूर्वाग्रह हो सकता है, जिससे क्यूपीसीआर प्रयोग के परिणाम गलत हो सकते हैं;
(4) miRNA: स्टेम-लूप प्राइमर या टेलिंग प्राइमर का उपयोग किया जा सकता है।

मात्रा निर्धारण के लिए रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन उत्पाद सीडीएनए को कितनी बार पतला किया जाना चाहिए?
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद का सीडीएनए प्राप्त करने के बाद, क्यूपीसीआर प्रयोगों के लिए सीडीएनए को कितनी बार पतला किया जाना चाहिए यह बहुत महत्वपूर्ण है।यदि सीडीएनए सांद्रता बहुत अधिक या बहुत कम है, तो प्रवर्धन दक्षता प्रभावित हो सकती है।क्या सीडीएनए सांद्रता मापी जा सकती है, और यह कैसे किया जाना चाहिए?
(1) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद की सीडीएनए सांद्रता को मापा नहीं जा सकता है, क्योंकि सीडीएनए उत्पाद के अलावा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अवशिष्ट बफर, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, प्राइमर इत्यादि भी होते हैं, जो एकाग्रता माप परिणामों में हस्तक्षेप करेंगे और OD260/280, OD260/230 अनुपात असामान्य हो जाएंगे और इसलिए सही सीडीएनए उपज को प्रतिबिंबित नहीं करेंगे।इस समय कुछ मित्र कहेंगे, तो शुद्धि के बाद एकाग्रता मापूंगा;यहां, फोरजीन याद दिलाना चाहेंगे कि सीडीएनए को शुद्ध करने की अनुशंसा नहीं की जाती है, क्योंकि उत्क्रमण द्वारा प्राप्त सीडीएनए की लंबाई अलग होती है, और शुद्धिकरण में छोटी सीडीएनए खो जाएगी।
(2) तो क्या करें?क्यूपीसीआर प्रयोग से पहले, सीडीएनए के कमजोर पड़ने की प्रवणता को पूर्व-प्रयोग के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है।उदाहरण के लिए: क्यूपीसीआर प्रयोगों के लिए टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए स्टॉक समाधान, 10 गुना कमजोर पड़ने और 100 गुना कमजोर पड़ने का उपयोग करें, और 18-28 की सीमा में सीटी मान के साथ कमजोर पड़ने वाले कारक का चयन करें।

miRNAs को रिवर्स ट्रांसक्राइब कैसे किया जाना चाहिए?
miRNA एक एकल-फंसे हुए छोटे अणु RNA है जिसका आकार लगभग 22 nt है जो प्रोटीन के लिए कोड नहीं करता है।इसकी छोटी लंबाई के कारण, पारंपरिक क्यूपीसीआर विधि से इसे सीधे मापना मुश्किल है, इसलिए अक्सर miRNA का विस्तार करना आवश्यक होता है;miRNA के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन विधियों में स्टेम-लूप विधि और टेलिंग विधि शामिल हैं।
स्टेम-लूप विधि स्टेम-लूप प्राइमरों को जोड़कर miRNA का विस्तार करना है।इस पता लगाने की विधि में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है, लेकिन पता लगाने का थ्रूपुट कम है।एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन केवल एक miRNA और एक आंतरिक संदर्भ का पता लगा सकता है;पूंछ-जोड़ने की विधि दो से बनी है यह दो एंजाइमों की संयुक्त क्रिया से पूरी होती है, जो पॉलीए पोलीमरेज़ और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस हैं।PolyA पोलीमरेज़ इसकी लंबाई बढ़ाने के लिए miRNA में PolyA टेल्स जोड़ने के लिए जिम्मेदार है, और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करता है।इस विधि में उच्च पहचान थ्रूपुट है और एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में कई miRNAs और आंतरिक संदर्भों का पता लगा सकता है, लेकिन स्टेम-लूप विधि में संवेदनशीलता और विशिष्टता कम है।