पीसीआर मशीन|क्या आप सचमुच समझते हैं?

नोबेल पुरस्कार विजेता पीसीआर तकनीक

1993 में अमेरिकी वैज्ञानिक मुलिस को रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार मिला और उनकी उपलब्धि पीसीआर तकनीक का आविष्कार थी।पीसीआर तकनीक का जादू निम्नलिखित विशेषताओं में है: सबसे पहले, प्रवर्धित किए जाने वाले डीएनए की मात्रा बेहद कम है, और सैद्धांतिक रूप से एक अणु का उपयोग प्रवर्धन के लिए किया जा सकता है;दूसरे, प्रवर्धन दक्षता अधिक है, और लक्ष्य जीन की मात्रा घातीय है।प्रवर्धन, कुछ ही घंटों में 10 मिलियन से अधिक बार।अब पीसीआर उपकरण का जीवन विज्ञान अनुसंधान और कई अन्य पहलुओं में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने लगा है।

थर्मल साइक्लर्स के विभिन्न मॉडल और निर्माता अलग-अलग प्रदर्शन और दोहराव प्रदर्शित कर सकते हैं।ये अंतर न केवल पीसीआर दक्षता को प्रभावित करते हैं बल्कि प्राप्त डेटा की सटीकता और स्थिरता को भी प्रभावित करते हैं।पीसीआर मशीन की विशेषताओं को समझने से हमें अपने प्रयोगों की सफलता को अधिकतम करने में मदद मिल सकती है।

हीटिंग मॉड्यूल

थर्मल साइक्लर के तापमान की सटीकता पीसीआर की सफलता या विफलता के लिए निर्णायक हो सकती है।विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीसीआर परिणाम प्राप्त करने के लिए हीटिंग ब्लॉक पर अच्छी तरह से अच्छी तापमान स्थिरता भी महत्वपूर्ण है।

थर्मल सटीकता सुनिश्चित करने का एक तरीका तापमान सत्यापन किट का उपयोग करके बार-बार परीक्षण करना और प्रशिक्षित पेशेवर द्वारा आवश्यकतानुसार पुन: अंशांकन करना है।तापमान सत्यापन परीक्षण आमतौर पर इसके लिए उपयोग किए जाते हैं:

आइसोथर्मल मोड में तापमान सेट करने के सापेक्ष अच्छी तरह से अच्छी सटीकता

तापमान रूपांतरण के बाद सेट तापमान के सापेक्ष अच्छी तरह से अच्छी सटीकता

ताप ढक्कन तापमान सटीकता

प्राइमर एनीलिंग तापमान नियंत्रण

ग्रेडिएंट तापमान नियंत्रण पीसीआर उपकरण का एक कार्य है जो पीसीआर में प्राइमर एनीलिंग के अनुकूलन की सुविधा प्रदान करता है।ग्रेडिएंट सेटिंग का उद्देश्य मॉड्यूल के बीच अलग-अलग तापमान प्राप्त करना है, और प्रत्येक कॉलम के बीच ≥2°C तापमान में वृद्धि और गिरावट से, इष्टतम प्राइमर एनीलिंग तापमान प्राप्त करने के लिए अलग-अलग तापमान का एक साथ परीक्षण किया जा सकता है।सैद्धांतिक रूप से, एक सच्चा ग्रेडिएंट मॉड्यूल के बीच रैखिक तापमान प्राप्त करता है।

हालाँकि, पारंपरिक ग्रेडिएंट थर्मल साइक्लर्स आम तौर पर एक एकल थर्मल ब्लॉक का उपयोग करते हैं और दोनों सिरों पर स्थित दो हीटिंग और कूलिंग तत्वों के माध्यम से तापमान को नियंत्रित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर निम्नलिखित सीमाएँ होती हैं:

केवल दो तापमान सेट किए जा सकते हैं: प्राइमर एनीलिंग के लिए उच्च और निम्न तापमान थर्मल मॉड्यूल के दोनों सिरों पर सेट किए जाते हैं, और मॉड्यूल के बीच अन्य तापमान की सटीक सेटिंग प्राप्त नहीं की जा सकती है

विभिन्न स्तंभों के बीच ताप विनिमय के कारण, मॉड्यूल पर विभिन्न क्षेत्रों के बीच का तापमान वास्तविक रैखिक ढाल के बजाय सिग्मॉइडल वक्र का अनुसरण करने की अधिक संभावना है।

नमूना तापमान

पीसीआर परिणामों की सटीकता के लिए नमूना तापमान को नियंत्रित करने के लिए थर्मल साइक्लर की क्षमता बहुत महत्वपूर्ण है।नमूना तापमान की भविष्यवाणी के लिए उपकरण-विशिष्ट पैरामीटर जैसे रैंप दर, होल्ड टाइम और एल्गोरिदम महत्वपूर्ण हैं।

पीसीआर मशीन के गर्म होने और ठंडा होने की दर का मतलब है कि एक निश्चित अवधि में होने वाले पीसीआर चरणों के बीच तापमान में बदलाव होता है।चूंकि गर्मी को मॉड्यूल से नमूने में स्थानांतरित होने में एक निश्चित समय लगता है, इसलिए नमूने की वास्तविक ताप और शीतलन दर धीमी होगी।इसलिए, तापमान परिवर्तन की गति की परिभाषा को अलग करने और समझने की आवश्यकता है।

अधिकतम या शिखर मॉड्यूल रैंप दर सबसे तेज़ तापमान परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करती है जिसे मॉड्यूल रैंप के दौरान बहुत कम समय में प्राप्त कर सकता है।

औसत ब्लॉक रैंप दर लंबी अवधि में तापमान परिवर्तन की दर का प्रतिनिधित्व करती है और पीसीआर मशीन की गति का अधिक प्रतिनिधि माप प्रदान करेगी।

अधिकतम नमूना तापन और शीतलन दर और औसत नमूना तापन और शीतलन दर नमूने द्वारा प्राप्त वास्तविक तापमान को दर्शाते हैं।नमूना गर्म करने और ठंडा करने की दर पीसीआर मशीन के प्रदर्शन और पीसीआर परिणामों पर इसके संभावित प्रभाव की अधिक सटीक तुलना प्रदान करेगी।

साइक्लर प्रतिस्थापन करते समय, रैंप रेट प्रोग्राम वाले एक उपकरण का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है जो आसान प्रतिस्थापन और पीसीआर दोहराव पर न्यूनतम प्रभाव के लिए पिछले मोड का अनुकरण करता है।

नमूना निर्धारित तापमान तक पहुंचने के बाद ही थर्मल साइक्लर को समयबद्ध चरणों के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए।इस तरह, निर्धारित तापमान पर नमूना बनाए रखने का समय ऑपरेटिंग प्रक्रिया में आवश्यक संबंधित चक्र स्थितियों के साथ अधिक सटीक रूप से बनाए रखा जाएगा।

थर्मल साइक्लर्स अक्सर जटिल गणितीय एल्गोरिदम का उपयोग करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूने पूर्व निर्धारित कार्यक्रम के अनुसार जल्दी से निर्धारित तापमान तक पहुंच सकें।प्रतिक्रिया प्रणाली की मात्रा और उपयोग किए गए पीसीआर प्लास्टिक की मोटाई के आधार पर, एल्गोरिदम नमूने के तापमान और निर्धारित तापमान तक पहुंचने में लगने वाले समय की भविष्यवाणी कर सकता है।इन एल्गोरिदम पर भरोसा करते हुए, थर्मल साइक्लर की हीटिंग या कूलिंग प्रक्रिया के दौरान, ब्लॉक तापमान आमतौर पर थर्मल ब्लॉक ओवरशूट या अंडरशूट नामक प्रक्रिया के माध्यम से निर्धारित मूल्य से अधिक हो जाएगा।ऐसा सेटअप यह सुनिश्चित करता है कि नमूना बिना ओवरशूटिंग या अंडरशूटिंग के जितनी जल्दी हो सके निर्धारित तापमान तक पहुंच जाए।

प्रायोगिक थ्रूपुट

थर्मल साइक्लर के थ्रूपुट को बढ़ाने वाले कारकों में रैंप दरें, थर्मल ब्लॉक कॉन्फ़िगरेशन और स्वचालन प्लेटफार्मों का एकीकरण शामिल हैं।

थर्मल साइक्लर की ताप और शीतलन दर उस गति को दर्शाती है जिस पर यह निर्धारित तापमान तक पहुंचता है।तापमान जितनी तेजी से बढ़ेगा और गिरेगा, पीसीआर उतनी ही तेजी से चलेगी, जिसका मतलब है कि एक निश्चित समय में अधिक प्रयोग पूरे किए जा सकते हैं।इसके अलावा, तेज़ डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके प्रयोगों को तेज किया जा सकता है।

पीसीआर प्रयोगों के लिए थर्मल साइक्लर मॉड्यूल का डिज़ाइन भी महत्वपूर्ण है।उदाहरण के लिए, बदली जाने योग्य मॉड्यूल प्रति रन नमूनों की संख्या में लचीलेपन की अनुमति देते हैं।इसके अलावा, व्यक्तिगत रूप से नियंत्रित मॉड्यूल वाले हीटिंग मॉड्यूल एक थर्मल साइक्लर पर एक साथ विभिन्न पीसीआर प्रोग्राम चलाने के लिए आदर्श हैं।

स्वचालित उच्च-थ्रूपुट पीसीआर के लिए, पिपेटिंग हैंडलिंग सिस्टम को नियंत्रित करने वाला सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम योग्य और संगत होना चाहिए।स्वचालित सिस्टम उच्च-थ्रूपुट पीसीआर प्रतिक्रियाएं करने के लिए आदर्श हैं क्योंकि उन्हें थोड़े से मानवीय हस्तक्षेप के साथ लगातार चलाया जा सकता है, जिससे मैन्युअल प्रयोगात्मक सेटअप के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है और एक निश्चित समय अवधि में प्रतिक्रियाओं की संख्या बढ़ जाती है।

थर्मल साइक्लर्स की विश्वसनीयता, स्थायित्व और गुणवत्ता आश्वासन

प्रदर्शन और थ्रूपुट क्षमताओं के अलावा, पीसीआर मशीन को कुछ बार-बार उपयोग, पर्यावरणीय तनाव और शिपिंग स्थितियों का सामना करने में भी सक्षम होना चाहिए।कुछ निर्माता रिपोर्ट कर सकते हैं कि उपकरण विश्वसनीयता और स्थायित्व परीक्षण कैसे करता है।संबंधित पीसीआर उपकरण का पता लगाने में शामिल हैं:

विश्वसनीयता: मैकेनिकल रिग्स का उपयोग थर्मल ढक्कन, नियंत्रण पैनल/टचस्क्रीन और तापमान साइक्लिंग मॉड्यूल जैसे अक्सर उपयोग किए जाने वाले उपकरण घटकों पर बार-बार परीक्षण करने के लिए किया जाता है।

परिवेशीय दबाव: पर्यावरण कक्षों का उपयोग नियमित प्रयोगों की विभिन्न स्थितियों, जैसे तापमान, आर्द्रता का अनुकरण करने के लिए किया जा सकता है।

शिपिंग परीक्षण: अंतर्राष्ट्रीय सुरक्षा शिपिंग एसोसिएशन के मानकों के अनुसार तीव्र झटका और कंपन परीक्षण किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उपकरण बिना क्षतिग्रस्त परिचालन स्थितियों में पहुंच सके।

पीसीआर मशीन के रखरखाव के लिए वारंटी और सेवा

कठोर विश्वसनीयता और स्थायित्व परीक्षण के बावजूद, थर्मल साइक्लर्स के पास अनिवार्य रूप से उपकरण के जीवन पर तकनीकी समस्याएं होती हैं।मन की शांति के लिए, उपकरण खरीदते समय निर्माता की वारंटी, सेवा और रखरखाव पर विचार किया जाना चाहिए।

कार्यकुशलता पर प्रभाव को कम करने के लिए ऑन-साइट/रिटर्न-टू-फ़ैक्टरी रखरखाव, दूरस्थ निगरानी सेवाएं, और रखरखाव प्रक्रिया में प्रतिस्थापन उपकरण इत्यादि जैसी सेवाओं का लचीलापन।

वारंटी अवधि की लंबाई, सेवा का टर्नअराउंड समय, तकनीकी सहायता की पहुंच और पेशेवर सहायता कर्मियों का कौशल।

प्रयोगशाला और संबंधित नियामक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए उपकरण स्थापना, संचालन, सहयोग और सत्यापन की व्यवहार्यता।यह सुनिश्चित करने के लिए कि उपकरण संबंधित मापदंडों के साथ ठीक से काम करता है, तापमान सत्यापन, परीक्षण और अंशांकन जैसी रखरखाव सेवाएं उपलब्ध हैं।

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