पीसीआर, एकाधिक पीसीआर, यथास्थान पीसीआर, रिवर्स पीसीआर, आरटी-पीसीआर, क्यूपीसीआर(1)–पीसीआर

हम विभिन्न पीसीआर की अवधारणाओं, चरणों और विवरणों को सुलझाएंगे

Ⅰ. पीसीआर

पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन, जिसे पीसीआर कहा जाता है, एक आणविक जैविक तकनीक है जिसका उपयोग विशिष्ट डीएनए टुकड़ों को बड़ा करने के लिए किया जाता है।इसे इन विट्रो में एक विशेष डीएनए प्रतिकृति के रूप में माना जा सकता है।डीएनए पोलीमरेज़ (डीएनए पॉलीमरेज़ I) की खोज 1955 की शुरुआत में की गई थी, और ई. कोली का क्लेनो फ्रैगमेंट, जिसमें प्रायोगिक मूल्य और व्यावहारिकता है, की खोज डॉ. एच. क्लेनो ने 1970 के दशक की शुरुआत में की थी, लेकिन क्योंकि यह एंजाइम तापमान सहन नहीं करता है, उच्च तापमान इसे ख़राब कर सकता है, इसलिए यह उच्च तापमान अध: पतन के साथ पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया को पूरा नहीं करता है।आज उपयोग में आने वाले एंजाइम (जिन्हें टैक पोलीमरेज़ कहा जाता है), 1976 में गर्म पानी के झरने वाले जीवाणु थर्मस एक्वाटिकस से अलग किए गए थे। इसकी विशेषता यह है कि यह उच्च तापमान का प्रतिरोध कर सकता है और एक आदर्श एंजाइम है, लेकिन 1980 के दशक के बाद इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।पीसीआर के मूल आदिम प्रोटोटाइप की मूल अवधारणा जीन की मरम्मत और नकल के समान है, जिसे 1971 में डॉ. केजेल क्लेपे द्वारा प्रस्तावित किया गया था। उन्होंने पहली सरल और अल्पकालिक जीन प्रतिलिपि प्रकाशित की (पीसीआर के पहले दो चक्र प्रतिक्रियाओं के समान)।आज विकसित पीसीआर को 1983 में डॉ. कैरी बी. मुलिस द्वारा विकसित किया गया था। डॉ. मुलिस ने उस वर्ष पीई कंपनियों को सेवा दी थी, इसलिए पीई को पीसीआर उद्योग में एक विशेष दर्जा प्राप्त है।डॉ. मुलिस ने आधिकारिक तौर पर 1985 में सैकी और अन्य लोगों के साथ पहला संबंधित पेपर प्रकाशित किया था। तब से, पीसीआर का उपयोग प्रतिदिन हजारों मील है, और कहा जा सकता है कि संबंधित पेपर की गुणवत्ता कई अन्य शोध विधियों को अरुचिकर बनाती है।इसके बाद, पीसीआर तकनीक का व्यापक रूप से जैविक वैज्ञानिक अनुसंधान और नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है, जो आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान की सबसे महत्वपूर्ण तकनीक बन गई है।मुलिस ने 1993 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार भी जीता।

पीसीआरसिद्धांत

पीसीआर तकनीक का मूल सिद्धांत डीएनए की प्राकृतिक प्रतिकृति प्रक्रिया के समान है, और इसकी विशिष्टता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर पर निर्भर करती है जो लक्ष्य अनुक्रम के दोनों सिरों की पूरक है।पीसीआर अध: पतन-एनीलिंग-विस्तारित तीन बुनियादी प्रतिक्रियाओं चरणों से बना है: ① टेम्पलेट डीएनए का अध: पतन: टेम्पलेट डीएनए को एक निश्चित अवधि के लिए लगभग 93 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के बाद, टेम्पलेट डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा गठित दोहरी-श्रृंखला डीएनए के लिए दोहरी डीएनए समाधान को छोड़कर, इसे एक एकल श्रृंखला बनाते हैं ताकि इसे अगले दौर की प्रतिक्रिया के लिए तैयार करने के लिए प्राइमर के साथ जोड़ा जा सके।②टेम्पलेट डीएनए और प्राइमर का एनीलिंग (यौगिक): टेम्प्लेट डीएनए के गर्म होने और एक श्रृंखला में विकृत होने के बाद, तापमान लगभग 55°C तक गिर जाता है।प्राइमर और टेम्पलेट डीएनए एकल-श्रृंखला का पूरक अनुक्रम।③प्राइमर का विस्तार: डीएनए टेम्पलेट-प्राइमर बाइंडिंग TaqDNA पोलीमरेज़ की क्रिया पर आधारित है, जिसमें प्रतिक्रिया कच्चे माल के रूप में dNTP है।प्रतिकृति के सिद्धांत को बनाए रखें, एक नई अर्ध-आरक्षित प्रतिलिपि श्रृंखला को संश्लेषित करें जो टेम्पलेट डीएनए श्रृंखला को पूरक करती है, और चक्र अध: पतन-एनीलिंग-विस्तार को दोहराती है तीन प्रक्रियाएं अधिक "अर्ध-आरक्षित प्रतिलिपि श्रृंखला" प्राप्त कर सकती हैं, और यह नई श्रृंखला फिर से उपलब्ध है अगले चक्र के लिए एक टेम्पलेट बनें।लूप को पूरा करने में 2-4 मिनट लगते हैं, लक्ष्य जीन को 2-3 घंटों में कई मिलियन गुना बढ़ाया जा सकता है।

मानकपीसीआरप्रतिक्रिया प्रणाली

पीसीआर प्रतिक्रिया के पांच तत्व

पीसीआर प्रतिक्रिया में मुख्य रूप से पांच प्रकार के पदार्थ शामिल होते हैं, अर्थात् प्राइमर, एंजाइम, डीएनटीपी, टेम्पलेट और बफर (एमजी2+ आवश्यक है)।[पीसीआर प्रक्रिया]

मानक पीसीआर प्रक्रिया को तीन चरणों में विभाजित किया गया है

1. डीएनए अध:पतन (90°C-96°C): थर्मल क्रिया के तहत दोहरी-श्रृंखला डीएनए टेम्पलेट, हाइड्रोजन बांड टूट जाते हैं, जिससे एकल-श्रृंखला डीएनए बनता है।

2. एनीलिंग (25℃ -65℃): सिस्टम का तापमान कम हो जाता है, प्राइमर को डीएनए टेम्पलेट के साथ जोड़कर एक स्थानीय दोहरी-श्रृंखला बनाई जाती है।

3. विस्तार (70℃ -75℃): टैक एंजाइम (लगभग 72°C, सबसे अच्छी गतिविधि) की कार्रवाई के तहत, dNTP का उपयोग कच्चे माल के रूप में किया जाता है, प्राइमर के 5′ छोर से → 3′ छोर तक विस्तारित होता है, संश्लेषण और टेम्पलेट एक दूसरे डीएनए श्रृंखला के पूरक होते हैं।

प्रत्येक चक्र विकृत, एनील्ड और विस्तारित होता है, जिससे डीएनए सामग्री दोगुनी हो जाती है।वर्तमान में, छोटे प्रवर्धन क्षेत्र के कारण, कुछ पीसीआर को बहुत कम समय में दोहराया जा सकता है, भले ही टैक एंजाइम गतिविधि इष्टतम न हो, इसलिए इसे दो चरणों में बदला जा सकता है, यानी, एनीलिंग और विस्तार एक ही समय में 60 डिग्री सेल्सियस-65 डिग्री सेल्सियस पर किया जा सकता है।उठाने और ठंडा करने की प्रक्रिया को कम करने और प्रतिक्रिया गति में सुधार करने के लिए।

पीसीआर प्रतिक्रिया सुविधाएँ

● उच्च-विशिष्टता

पीसीआर प्रतिक्रिया के विशिष्ट निर्णायक कारक हैं: ①प्राइमर और टेम्पलेट डीएनए का विशिष्ट संयोजन।②बेस पेयरिंग का सिद्धांत।③TaqDNA पोलीमरेज़ संश्लेषण प्रतिक्रिया की वफादारी।④लक्ष्य जीन की विशिष्टता और रूढ़िवादिता।

प्राइमर और टेम्प्लेट का सही संयोजन महत्वपूर्ण है।प्राइमर और टेम्पलेट की बाइंडिंग और प्राइमर श्रृंखला का विस्तार क्षारीय आधार मिलान के सिद्धांत पर आधारित है।पोलीमरेज़ संश्लेषण प्रतिक्रियाओं की निष्ठा और प्रतिक्रिया में टेम्पलेट और प्राइमर के बंधन (यौगिक) को बनाने के लिए टाक डीएनए पोलीमरेज़ के उच्च तापमान प्रतिरोध को उच्च तापमान पर किया जा सकता है।संयोजन की विशिष्टता बहुत बढ़ गई है।क्लिप उच्च स्तर की शुद्धता बनाए रख सकती है।उच्च रूढ़िवादिता एवं उच्च रूढ़िवादिता वाले लक्ष्य आनुवंशिक क्षेत्र का चयन करने से इसकी विशिष्टता अधिक होती है।

● उच्च संवेदनशीलता

पीसीआर उत्पादों की उत्पादन मात्रा सूचकांक द्वारा बढ़ाई जाती है, जो माइक्रोकंट्रोलर के स्तर को माइक्रोग्राम (μg = -6) के स्तर तक बढ़ाने के लिए पिकर (पीजी = 10-12) के शुरुआती टेम्पलेट का विस्तार कर सकती है।1 मिलियन कोशिकाओं में से एक लक्ष्य कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है;वायरस का पता लगाने में, पीसीआर की संवेदनशीलता 3 आरएफयू (खाली धब्बे वाली इकाइयां) तक पहुंच सकती है;जीवाणु विज्ञान में न्यूनतम पता लगाने की दर 3 बैक्टीरिया है।

● सरल और तेज़

पीसीआर प्रतिबिंब एक उच्च तापमान टैक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करता है, जो एक समय में प्रतिक्रिया समाधान जोड़ता है, यानी डीएनए प्रवर्धन समाधान और जल स्नान पॉट पर एक अध: पतन-एनील-विस्तार प्रतिक्रिया।आम तौर पर, प्रवर्धन प्रतिक्रिया 2 से 4 घंटे में पूरी हो जाती है।संवर्धित उत्पादों का विश्लेषण आमतौर पर विद्युत तलवार द्वारा किया जाता है, और इसमें आइसोटोप का उपयोग नहीं करना पड़ता है, कोई रेडियोधर्मी प्रदूषण नहीं होता है, और आसान प्रचार होता है।

● नमूने की शुद्धता कम है

वायरस या बैक्टीरिया और कल्चर कोशिकाओं को अलग करने की कोई आवश्यकता नहीं है।डीएनए क्रूड उत्पाद और आरएनए का उपयोग एम्पलीफायरों के रूप में किया जा सकता है।डीएनए प्रवर्धन का पता लगाने का उपयोग सीधे रक्त, शरीर के तरल पदार्थ, खांसी धोने वाले तरल पदार्थ, बाल, कोशिकाओं और जीवित ऊतक जैसे नैदानिक ​​​​नमूनों का उपयोग करके किया जा सकता है।

पीसीआरसामान्य समस्या

● गलत नकारात्मक, कोई प्रवर्धित बैंड नहीं

पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रमुख चरणों में शामिल हैं: ① टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड की तैयारी, ② प्राइमरों की गुणवत्ता और विशिष्टता, ③ एंजाइमों की गुणवत्ता ④ पीसीआर चक्र की स्थिति।कारण ढूंढ़ते हुए उपरोक्त कड़ियों का भी विश्लेषण एवं अध्ययन किया जाना चाहिए।

टेम्प्लेट: ① टेम्प्लेट में विविध प्रोटीन होता है, ② टेम्प्लेट में एक टाक एंजाइम अवरोधक होता है, ③ टेम्प्लेट में प्रोटीन समाप्त नहीं होता है, विशेष रूप से गुणसूत्र में समूह प्रोटीन।⑤ डेमिनर न्यूक्लिक एसिड अध: पतन पूरी तरह से नहीं है।जब एंजाइमों और प्राइमरों की गुणवत्ता अच्छी होती है, तो कोई प्रवर्धन बैंड नहीं होता है, जो कि नमूनों के पाचन उपचार की सबसे अधिक संभावना है।टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रक्रिया में कुछ गड़बड़ है, इसलिए एक प्रभावी और स्थिर पाचन समाधान तैयार करने के लिए, इसकी प्रक्रिया को ठीक किया जाना चाहिए और मनमाने ढंग से नहीं बदला जाना चाहिए।

एंजाइम निष्क्रियता: एक नए एंजाइम या पुराने और नए दोनों एंजाइमों का एक साथ उपयोग किया जाना चाहिए ताकि यह विश्लेषण किया जा सके कि क्या एंजाइम गतिविधि खो गई है या अपर्याप्त है, जिससे गलत नकारात्मक परिणाम सामने आते हैं।यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि टाक एंजाइम या एथिडियम ब्रोमाइड को कभी-कभी भुला दिया जाता है।

प्राइमर: प्राइमर की गुणवत्ता, प्राइमर की सांद्रता, और क्या दोनों प्राइमरों की सांद्रता सममित है।यह पीसीआर विफलता का एक सामान्य कारण है या बढ़ता बैंड आदर्श नहीं है और इसके फैलने का खतरा है।कुछ बैच नंबरों के प्राइमरों की गुणवत्ता में समस्याएँ हैं।दो प्राइमरों में उच्च सांद्रता और कम सांद्रता होती है, जिससे कम दक्षता वाला असममित प्रवर्धन होता है।प्रतिउपाय ये हैं: ① इकाइयों को संश्लेषित करने के लिए एक अच्छे प्राइमर का चयन करें।② प्राइमर की सांद्रता न केवल OD मान पर निर्भर करती है, बल्कि अगर शुगर जेल वैद्युतकणसंचलन बनाने के लिए प्राइमर के मूल तरल पर भी ध्यान देती है।एक प्राइमर स्ट्रिप ज़ोन होना चाहिए, और दोनों प्राइमरों की चमक आम तौर पर एक जैसी होनी चाहिए।बेल्ट, पीसीआर इस समय विफल हो सकता है, और इसे प्राइमर संश्लेषण इकाई के साथ हल किया जाना चाहिए।यदि प्राइमर अधिक है, तो चमक कम है, और पतला होने पर इसकी सांद्रता संतुलित होनी चाहिए।③ रेफ्रिजरेटर के भागों को बार-बार जमने या लंबे समय तक प्रशीतन से बचाने के लिए प्राइमर को उच्च सांद्रता में संग्रहीत और संग्रहित किया जाना चाहिए, जिससे प्राइमर खराब हो जाएगा और ख़राब हो जाएगा।④ प्राइमर का डिज़ाइन अनुचित है, जैसे प्राइमर की लंबाई अपर्याप्त है, और प्राइमर के बीच डी क्लस्टर बनता है।

Mg2+सांद्रता: Mg2+आयन सांद्रता का पीसीआर प्रवर्धन दक्षता पर बहुत प्रभाव पड़ता है।अत्यधिक एकाग्रता पीसीआर प्रवर्धन के विपरीत लिंग को कम कर सकती है।यदि सांद्रता बहुत कम है, तो पीसीआर प्रवर्धन आउटपुट विस्तार बैंड के बिना भी पीसीआर प्रवर्धन को विफल कर देगा।

प्रतिक्रिया मात्रा में परिवर्तन: पीसीआर प्रवर्धन में उपयोग की जाने वाली मात्रा 20ul, 30ul, और 50ul या 100uL है, पीसीआर प्रवर्धन के लिए आवेदन की बड़ी मात्रा वैज्ञानिक अनुसंधान और नैदानिक ​​​​परीक्षण के विभिन्न उद्देश्यों के अनुसार निर्धारित की जाती है।20ul जैसी छोटी मात्रा बनाने के बाद, आकार बनाते समय एक कॉर्ड की स्थिति बनाना आवश्यक है, अन्यथा यह विफल हो जाएगा।

भौतिक कारण: पीसीआर प्रवर्धन के लिए परिवर्तन बहुत महत्वपूर्ण है।यदि अध: पतन तापमान कम है, तो अध: पतन का समय कम है, यह गलत नकारात्मक में घटित होने की संभावना है;बहुत कम एनीलिंग तापमान गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कारण बन सकता है और विशिष्ट प्रवर्धन दक्षता को कम कर सकता है।पीसीआर प्रवर्धन दक्षता को कम करने के लिए प्राइमरों और टेम्पलेट्स के संयोजन को अत्यधिक प्रभावित करते हैं।कभी-कभी एक्सटेंशन या पानी में घुलनशील कुकर में परिवर्तनशीलता, एनीलिंग और विस्तारित तापमान का पता लगाने के लिए मानक थर्मामीटर का उपयोग करना आवश्यक होता है, जो पीसीआर की विफलता के कारणों में से एक है।

लक्ष्य अनुक्रम वेरिएंट: यदि लक्ष्य अनुक्रम होता है, उत्परिवर्तन या विलोपन होता है, प्रोटोटाइप और टेम्पलेट का संयोजन संयुक्त होता है, या लक्ष्य अनुक्रम की कमी के कारण, प्राइमर और टेम्पलेट पूरक अनुक्रम खो देंगे, और इसका पीसीआर प्रवर्धन सफल नहीं होगा।

● गलत सकारात्मक

पीसीआर प्रवर्धन बैंड लक्ष्य अनुक्रम बैंड के अनुरूप प्रतीत होता है, और कभी-कभी इसका बैंड अधिक साफ और ऊंचा होता है।

प्राइमर डिज़ाइन उपयुक्त नहीं है: चयनित प्रवर्धन अनुक्रम और गैर-उद्देश्यीय प्रवर्धन अनुक्रम समरूप हैं, इसलिए जब पीसीआर प्रवर्धन होता है, तो प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद गैर-उद्देश्यीय अनुक्रम होते हैं।लक्ष्य अनुक्रम बहुत छोटा है या प्राइमर बहुत छोटा है, और यह गलत सकारात्मक होने का खतरा है।पुनः डिज़ाइन करने की आवश्यकता है।

लक्ष्य अनुक्रम या प्रवर्धन उत्पादों का क्रॉस प्रदूषण: इस प्रदूषण के दो कारण हैं: पहला, संपूर्ण जीनोम या बड़े खंडों का क्रॉस-प्रदूषण, जिससे झूठी सकारात्मकता उत्पन्न होती है।इस प्रकार की झूठी सकारात्मकता को निम्नलिखित तरीकों से हल किया जा सकता है: लक्ष्य अनुक्रम को नमूना बंदूक में साँस लेने या केन्द्रापसारक ट्यूब से बाहर निकलने से रोकने के लिए ऑपरेशन के दौरान सावधान और सौम्य रहें।उन एंजाइमों और पदार्थों को छोड़कर जो उच्च तापमान का सामना नहीं कर सकते, सभी अभिकर्मकों या उपकरणों को उच्च दबाव से कीटाणुरहित किया जाना चाहिए।केन्द्रापसारक पाइप और नमूनों का उपयोग एक ही समय में किया जाना चाहिए।जब आवश्यक हो, नमूने जोड़ने से पहले, प्रतिक्रिया ट्यूब और अभिकर्मक को मौजूदा न्यूक्लिक एसिड को नष्ट करने के लिए पराबैंगनी किरणों के संपर्क में लाया जाता है।दूसरा, वायु प्रदूषण में छोटे-छोटे अंश।ये छोटे टुकड़े लक्ष्य अनुक्रम से छोटे हैं, लेकिन उनमें कुछ निश्चित समरूपता है।इसे एक दूसरे के साथ जोड़ा जा सकता है.प्राइमरों को पूरक करने के बाद, पीसीआर उत्पाद का विस्तार किया जा सकता है, जिससे गलत सकारात्मक उत्पादन होगा।इसका उपयोग नेस्ट पीसीआर विधि को कम करने या समाप्त करने के लिए किया जा सकता है।

● निरर्थक प्रवर्धन बैंड प्रकट होना

पीसीआर प्रवर्धन के बाद दिखाई देने वाले बैंड अपेक्षित आकार, या बड़े या छोटे, या एक ही समय में, या एक ही समय में, विशिष्ट प्रवर्धन बैंड और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बैंड के साथ असंगत हैं।गैर-विशिष्ट बैंडों का उद्भव इस प्रकार है: सबसे पहले, प्राइमर लक्ष्य अनुक्रम के अपूर्ण पूरक होते हैं, या डि क्लस्टर बनाने के लिए प्राइमर का पोलीमराइजेशन होता है।दूसरा यह है कि MG2+आयनों की सांद्रता बहुत अधिक है, एनीलिंग तापमान बहुत कम है, और पीसीआर चक्रों की संख्या संबंधित है।दूसरे, एंजाइमों की गुणवत्ता और मात्रा।अक्सर, कुछ स्रोतों के एंजाइम गैर-विशेष बैंड से ग्रस्त होते हैं और दूसरे स्रोत के एंजाइम नहीं होते हैं।कभी-कभी एंजाइमों का गैर-विशिष्ट प्रवर्धन भी होता है।जवाबी उपाय हैं: यदि आवश्यक हो तो आकर्षक को फिर से डिज़ाइन किया जाए।एंजाइम की मात्रा कम करें या किसी अन्य स्रोत के एंजाइम को बदलें।प्राथमिक की मात्रा कम करें, टेम्पलेट्स की मात्रा उचित रूप से बढ़ाएं और चक्रों की संख्या कम करें।एनीलिंग तापमान को उचित रूप से बढ़ाएं या दो तापमान बिंदु विधि (93 डिग्री सेल्सियस अध: पतन, एनीलिंग और लगभग 65 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार) का उपयोग करें।

● परतदार टो या स्मीयर टेप दिखाई देना

पीसीआर प्रवर्धन कभी-कभी लागू या खोलदार या कालीन जैसी बेल्ट प्रतीत होता है।कारण, एंजाइमों की अत्यधिक मात्रा या एंजाइम की खराब गुणवत्ता के कारण, dNTP सांद्रता बहुत अधिक है, Mg2+ सांद्रता बहुत अधिक है, एनीलिंग तापमान बहुत कम है, और चक्रों की संख्या बहुत अधिक है।जवाबी उपाय हैं: ①एंजाइम की मात्रा कम करें, या किसी अन्य स्रोत के एंजाइम को बदलें।②dNTP की सांद्रता को कम करें ③Mg2+ सांद्रता को उचित रूप से कम करें।④टेम्प्लेट की मात्रा बढ़ाएँ और चक्रों की संख्या कम करें।

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◮ किट तेजी से और कुशलता से वायरल आरएनए या ट्रेस आरएनए का मात्रात्मक विश्लेषण कर सकती है।

◮ किट प्रतिक्रिया की प्रवर्धन दक्षता और विशिष्टता को प्रभावी ढंग से सुधारने के लिए एक अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणाली के साथ मिलकर एक अद्वितीय फोरजीन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मक और फोरजीन हॉटस्टार टैक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करती है।

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आरटी आसान^TMद्वितीय (मास्टर प्रीमिक्स के लिए प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण के लिएवास्तविक समय पीसीआर)

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-कुशल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रणाली, पहले स्ट्रैंड सीडीएनए के संश्लेषण को पूरा करने में केवल 15 मिनट लगते हैं।

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-रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम में उच्च तापीय स्थिरता है, इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान 42 ℃ है, और 50 ℃ पर अभी भी इसका रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रदर्शन अच्छा है।