पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) 30 से अधिक वर्षों के इतिहास के साथ इन-विट्रो डीएनए प्रवर्धन प्रौद्योगिकियों में से एक है।

पीसीआर प्रौद्योगिकी की शुरुआत 1983 में सेटस, यूएसए के कैरी मुलिस ने की थी। मुलिस ने 1985 में पीसीआर पेटेंट के लिए आवेदन किया था और उसी वर्ष विज्ञान पर पहला पीसीआर अकादमिक पेपर प्रकाशित किया था।मुलिस को उनके काम के लिए 1993 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था।

पीसीआर के बुनियादी सिद्धांत

पीसीआर लक्ष्य डीएनए अंशों को दस लाख से अधिक गुना तक बढ़ा सकता है।सिद्धांत डीएनए पोलीमरेज़ के उत्प्रेरण के अंतर्गत है, जिसमें मूल स्ट्रैंड डीएनए को एक टेम्पलेट के रूप में और विशिष्ट प्राइमर को विस्तार के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है।इसे विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार जैसे चरणों के माध्यम से इन विट्रो में दोहराया जाता है।बेटी स्ट्रैंड डीएनए की प्रक्रिया मूल स्ट्रैंड टेम्पलेट डीएनए की पूरक है।

मानक पीसीआर प्रक्रिया को तीन चरणों में विभाजित किया गया है:

1.विकृतीकरण: डीएनए डबल स्ट्रैंड को अलग करने के लिए उच्च तापमान का उपयोग करें।उच्च तापमान (93-98℃) पर डीएनए डबल स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बंधन टूट जाता है।

2.एनीलिंग: डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को अलग करने के बाद, तापमान कम करें ताकि प्राइमर सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए से जुड़ सके।

3. विस्तार: तापमान कम होने पर डीएनए पोलीमरेज़ प्राइमर से बंधे डीएनए स्ट्रैंड के साथ पूरक स्ट्रैंड को संश्लेषित करना शुरू कर देता है।जब विस्तार पूरा हो जाता है, तो एक चक्र पूरा हो जाता है, और डीएनए टुकड़ों की संख्या दोगुनी हो जाती है

इन तीन चरणों को 25-35 बार दोहराने से डीएनए टुकड़ों की संख्या तेजी से बढ़ जाएगी।

पीसीआर की सरलता यह है कि अलग-अलग लक्ष्य जीनों के लिए अलग-अलग प्राइमरों को डिज़ाइन किया जा सकता है, ताकि लक्ष्य जीन के टुकड़ों को कम समय में बढ़ाया जा सके।

अब तक, पीसीआर को तीन श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है, अर्थात् साधारण पीसीआर, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर और डिजिटल पीसीआर।

साधारण पीसीआर की पहली पीढ़ी

लक्ष्य जीन को बढ़ाने के लिए एक साधारण पीसीआर प्रवर्धन उपकरण का उपयोग करें, और फिर उत्पाद का पता लगाने के लिए एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करें, केवल गुणात्मक विश्लेषण किया जा सकता है।

पहली पीढ़ी के पीसीआर के मुख्य नुकसान:

1. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन और गलत सकारात्मक परिणामों की संभावना।

2. पता लगाने में लंबा समय लगता है और ऑपरेशन बोझिल है।

3.केवल गुणात्मक परीक्षण ही किया जा सकता है

दूसरी पीढ़ी की रीयल-टाइम पीसीआर

रियल-टाइम पीसीआर, जिसे क्यूपीसीआर के रूप में भी जाना जाता है, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता है जो प्रतिक्रिया प्रणाली की प्रगति का संकेत दे सकता है, और फ्लोरोसेंट संकेतों के संचय के माध्यम से प्रवर्धित उत्पादों के संचय की निगरानी करता है, और फ्लोरोसेंस वक्र के माध्यम से परिणामों का न्याय करता है।इसे Cq मान और मानक वक्र की सहायता से परिमाणित किया जा सकता है।

क्योंकि क्यूपीसीआर तकनीक एक बंद प्रणाली में की जाती है, संदूषण की संभावना कम हो जाती है, और मात्रात्मक पहचान के लिए प्रतिदीप्ति संकेत की निगरानी की जा सकती है, इसलिए यह नैदानिक ​​​​अभ्यास में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और पीसीआर में प्रमुख तकनीक बन गई है।

वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट पदार्थों को विभाजित किया जा सकता है: टैकमैन फ्लोरोसेंट जांच, आणविक बीकन और फ्लोरोसेंट डाई।

1)ताकमान फ्लोरोसेंट जांच:

पीसीआर प्रवर्धन के दौरान, प्राइमर की एक जोड़ी जोड़ते समय एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच जोड़ी जाती है।जांच एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड है, और दोनों सिरों को एक रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह और एक क्वेंचर फ्लोरोसेंट समूह के साथ लेबल किया गया है।

जब जांच बरकरार रहती है, तो रिपोर्टर समूह द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट सिग्नल शमन समूह द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है;पीसीआर प्रवर्धन के दौरान, टैक एंजाइम की 5′-3′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि जांच को तोड़ देती है और ख़राब कर देती है, जिससे रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह और क्वेंचर फ्लोरोसेंट समूह अलग हो जाता है, ताकि प्रतिदीप्ति निगरानी प्रणाली प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त कर सके, अर्थात, हर बार जब डीएनए स्ट्रैंड को प्रवर्धित किया जाता है, तो एक फ्लोरोसेंट अणु बनता है, और प्रतिदीप्ति संकेत का संचय पीसीआर उत्पाद के निर्माण के साथ पूरी तरह से सिंक्रनाइज़ होता है।

2) SYBR फ्लोरोसेंट डाई:

पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में, SYBR फ्लोरोसेंट डाई की अधिकता जोड़ी जाती है।एसवाईबीआर फ्लोरोसेंट डाई को डीएनए डबल-स्ट्रैंड में गैर-विशेष रूप से शामिल किए जाने के बाद, यह एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करता है।एसवाईबीआर डाई अणु जो श्रृंखला में शामिल नहीं है, किसी भी फ्लोरोसेंट सिग्नल का उत्सर्जन नहीं करेगा, जिससे फ्लोरोसेंट सिग्नल सुनिश्चित होगा। पीसीआर उत्पादों में वृद्धि पूरी तरह से पीसीआर उत्पादों में वृद्धि के साथ सिंक्रनाइज़ है।एसवाईबीआर केवल डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए से बंधता है, इसलिए पिघलने वाले वक्र का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि पीसीआर प्रतिक्रिया विशिष्ट है या नहीं।

3) आणविक बीकन:

यह एक स्टेम-लूप डबल-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच है जो 5वें और 3वें सिरे पर लगभग 8 आधारों की हेयरपिन संरचना बनाती है।दोनों सिरों पर न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम पूरक रूप से युग्मित होते हैं, जिससे फ्लोरोसेंट समूह और शमन समूह तंग हो जाते हैं।बंद करें, कोई प्रतिदीप्ति उत्पन्न नहीं होगी।

पीसीआर उत्पाद उत्पन्न होने के बाद, एनीलिंग प्रक्रिया के दौरान, आणविक बीकन के मध्य भाग को एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम के साथ जोड़ा जाता है, और फ्लोरोसेंट जीन को प्रतिदीप्ति उत्पन्न करने के लिए क्वेंचर जीन से अलग किया जाता है।

दूसरी पीढ़ी के पीसीआर के मुख्य नुकसान:

संवेदनशीलता में अभी भी कमी है, और कम-प्रतिलिपि नमूनों का पता लगाना गलत है।

पृष्ठभूमि मान का प्रभाव होता है, और परिणाम हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशील होता है।

जब प्रतिक्रिया प्रणाली में पीसीआर अवरोधक होते हैं, तो पता लगाने के परिणाम हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशील होते हैं।

तीसरी पीढ़ी का डिजिटल पीसीआर

डिजिटल पीसीआर (डिजिटलपीसीआर, डीपीसीआर, डिग-पीसीआर) एंड-पॉइंट डिटेक्शन के माध्यम से लक्ष्य अनुक्रम की कॉपी संख्या की गणना करता है, और आंतरिक नियंत्रण और मानक वक्रों का उपयोग किए बिना सटीक पूर्ण मात्रात्मक पहचान कर सकता है।

डिजिटल पीसीआर अंत-बिंदु पहचान का उपयोग करता है और सीटी मान (चक्र सीमा) पर निर्भर नहीं करता है, इसलिए डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया प्रवर्धन दक्षता से कम प्रभावित होती है, और उच्च सटीकता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया अवरोधकों के प्रति सहनशीलता में सुधार होता है।

उच्च संवेदनशीलता और उच्च सटीकता की विशेषताओं के कारण, यह पीसीआर प्रतिक्रिया अवरोधकों द्वारा आसानी से हस्तक्षेप नहीं किया जाता है, और यह मानक उत्पादों के बिना सही पूर्ण मात्रा का ठहराव प्राप्त कर सकता है, जो एक अनुसंधान और अनुप्रयोग हॉटस्पॉट बन गया है।

प्रतिक्रिया इकाई के विभिन्न रूपों के अनुसार, इसे तीन मुख्य प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: माइक्रोफ्लुइडिक, चिप और ड्रॉपलेट सिस्टम।

1) माइक्रोफ्लुइडिक डिजिटल पीसीआर, एमडीपीसीआर:

माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के आधार पर डीएनए टेम्पलेट को अलग किया जाता है।माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक नमूना नैनो-अपग्रेडिंग या छोटी बूंदों की पीढ़ी का एहसास कर सकती है, लेकिन बूंदों को एक विशेष सोखने की विधि की आवश्यकता होती है और फिर पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली के साथ जोड़ा जाता है।एमडीपीसीआर को धीरे-धीरे अन्य तरीकों से प्रतिस्थापित करके अपनाया गया है।

2) ड्रॉपलेट-आधारित डिजिटल पीसीआर, डीडीपीसीआर:

नमूने को बूंदों में संसाधित करने के लिए पानी-में-तेल बूंद उत्पादन तकनीक का उपयोग करें, और न्यूक्लिक एसिड अणुओं वाले प्रतिक्रिया प्रणाली को हजारों नैनोस्केल बूंदों में विभाजित करें, जिनमें से प्रत्येक में पता लगाने के लिए न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य अणु शामिल नहीं है, या परीक्षण के लिए एक से कई न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य अणु शामिल हैं।

3) चिप-आधारित डिजिटल पीसीआर, सीडीपीसीआर:

सिलिकॉन वेफर्स या क्वार्ट्ज ग्लास पर कई माइक्रोट्यूब और माइक्रोकैविटी को उकेरने के लिए एकीकृत द्रव मार्ग प्रौद्योगिकी का उपयोग करें, और विभिन्न नियंत्रण वाल्वों के माध्यम से समाधान के प्रवाह को नियंत्रित करें, और पूर्ण परिमाणीकरण प्राप्त करने के लिए डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया कुओं में नमूना तरल को एक ही आकार के नैनोमीटर में विभाजित करें।

तीसरी पीढ़ी पीसीआर के मुख्य नुकसान:

उपकरण और अभिकर्मक महंगे हैं।

टेम्पलेट गुणवत्ता आवश्यकताएँ अधिक हैं।यदि टेम्पलेट मात्रा माइक्रोसिस्टम मात्रा से अधिक है, तो मात्रा निर्धारित करना असंभव होगा, और यदि यह बहुत छोटा है, तो मात्रा निर्धारण सटीकता कम हो जाएगी।

गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होने पर गलत सकारात्मकताएं भी उत्पन्न हो सकती हैं।