COVID-19 एक संक्रामक रोग है जो सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस टाइप 2 के कारण होता है। जब कोई व्यक्ति संक्रमित होता है, तो सबसे आम लक्षणों में बुखार, खांसी और सांस लेने में तकलीफ शामिल होती है।

परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूने नासॉफिरिन्जियल स्वैब या ऑरोफरीन्जियल स्वैब द्वारा एकत्र किए जा सकते हैं।

पीसीआर क्या है?

कोरोना वायरस का पता लगाने की मानक विधि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, पीसीआर है।यह आणविक जीव विज्ञान में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है।यह लाखों से अरबों विशिष्ट डीएनए अंशों की त्वरित प्रतिलिपि बना सकता है।

नए कोरोनोवायरस में एक बहुत लंबा एकल-फंसे आरएनए जीनोम होता है।पीसीआर द्वारा इन वायरस का पता लगाने के लिए, आरएनए अणुओं को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा उनके पूरक डीएनए अनुक्रमों में परिवर्तित किया जाना चाहिए, और फिर नए संश्लेषित डीएनए को मानक पीसीआर प्रक्रियाओं द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है, जिसे आमतौर पर आरटी-पीसीआर के रूप में जाना जाता है।

आरटी-पीसीआर प्रक्रिया

आरएनए निष्कर्षण

इस विधि को निष्पादित करने के लिए, वायरल आरएनए को मूल रूप से निकाला जाना चाहिए।सुविधाजनक, तेज़ और प्रभावी पृथक्करण के लिए विभिन्न प्रकार की आरएनए शुद्धि किटों का उपयोग किया जा सकता है।

एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके वायरल आरएनए निकालने के लिए, पहले नमूने को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और फिर इसे लाइसिस बफर के साथ मिलाएं।यह बफ़र अत्यधिक विकृत है और इसमें आमतौर पर फिनोल और गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट होते हैं।इसके अलावा, अक्षुण्ण वायरल आरएनए के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए RNase अवरोधक आमतौर पर लिसिस बफर में मौजूद होते हैं।

लाइसिस बफर जोड़ने के बाद, मिक्सिंग ट्यूब को पल्स द्वारा भंवर में डालें और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।फिर वायरस को लाइसिस बफर द्वारा प्रदान की गई अत्यधिक विकृतीकरण स्थितियों के तहत लीज किया जाता है।

नमूना लीज़ होने के बाद, शुद्धिकरण प्रक्रिया के लिए एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग किया जाता है।नमूना को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लोड किया जाता है और फिर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है।

यह प्रक्रिया एक ठोस चरण निष्कर्षण विधि है जिसमें स्थिर चरण में सिलिका जेल मैट्रिक्स होता है।

इष्टतम नमक और पीएच स्थितियों के तहत, आरएनए अणु सिलिका झिल्ली से बंध जाते हैं।

साथ ही प्रोटीन और अन्य दूषित पदार्थ भी दूर हो जाते हैं।

सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को एक साफ संग्रह ट्यूब में डालें, छान लें, और फिर वॉशिंग बफर डालें।

झिल्ली के माध्यम से वॉश बफर को मजबूर करने के लिए ट्यूब को फिर से सेंट्रीफ्यूज में रखें।यह झिल्ली से शेष सभी अशुद्धियों को हटा देगा, केवल आरएनए सिलिका जेल से बंधा रहेगा।

नमूना धोए जाने के बाद, ट्यूब को एक साफ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें और रेफरेंस बफर डालें।

इसके बाद झिल्ली के माध्यम से निक्षालन बफर को मजबूर करने के लिए इसे सेंट्रीफ्यूज किया जाता है।रेफरेंस बफर स्पिन कॉलम से वायरल आरएनए को हटा देता है और प्रोटीन, अवरोधक और अन्य दूषित पदार्थों से मुक्त शुद्ध आरएनए प्राप्त करता है।

चरण दो

मिश्रित सांद्रण

वायरल आरएनए को निकालने के बाद, अगला कदम पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करना है।इस चरण में, सांद्रण का उपयोग किया जाता है।यह संकेंद्रित घोल एक प्रीमिक्स्ड संकेंद्रित घोल है जिसमें प्रीमिक्स, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, न्यूक्लियोटाइड्स, फॉरवर्ड प्राइमर, रिवर्स प्राइमर, टैकमैन प्रोब और डीएनए पोलीमरेज़ शामिल हैं।

अंत में, इस प्रतिक्रिया मिश्रण को पूरा करने के लिए, आरएनए टेम्पलेट जोड़ा जाता है।ट्यूबों को पल्स वोर्टेक्सिंग द्वारा मिश्रित किया जाता है, और फिर प्रतिक्रिया मिश्रण को पीसीआर प्लेट में लोड किया जाता है।पीसीआर प्लेट में आमतौर पर 96 कुएं होते हैं और एक ही समय में कई नमूनों का विश्लेषण कर सकते हैं।

चरण 3

पीसीआर प्रवर्धन

इसके बाद, प्लेट को पीसीआर मशीन में रखें, जो अनिवार्य रूप से एक थर्मल साइक्लर है।

वास्तविक समय आरटी-पीसीआर का उपयोग आरडीआरपी जीन, ई जीन और एन जीन में लक्ष्य अनुक्रम को बढ़ाकर 2019 उपन्यास कोरोनवायरस का पता लगाने के लिए किया जाता है।लक्ष्य जीन का चुनाव प्राइमर और जांच अनुक्रम पर निर्भर करता है।

आरटी-पीसीआर का पहला चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन है।पूरक डीएनए का पहला स्ट्रैंड संश्लेषित किया जाता है, जो पीसीआर रिवर्स प्राइमर द्वारा शुरू किया जाता है, जो वायरल आरएनए जीनोम के पूरक भाग से जुड़ता है।फिर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस वायरल आरएनए के पूरक डीएनए को संश्लेषित करने के लिए प्राइमर के 3′अंत में डीएनए न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है।इस चरण का तापमान और अवधि प्राइमर, लक्ष्य आरएनए और उपयोग किए गए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पर निर्भर करती है।

इसके बाद, एक प्रारंभिक विकृतीकरण चरण लागू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप आरएनए-डीएनए हाइब्रिड का विकृतीकरण होता है।डीएनए पोलीमरेज़ को सक्रिय करने के लिए यह कदम आवश्यक है।उसी समय, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय हो जाता है।

पीसीआर में थर्मल चक्रों की एक श्रृंखला होती है।प्रत्येक चक्र में विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार चरण होते हैं।

विकृतीकरण चरण में प्रतिक्रिया कक्ष को 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना और डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्पलेट के विकृतीकरण के लिए इसका उपयोग करना शामिल है।

अगले चरण में, प्रतिक्रिया तापमान को 58 डिग्री सेल्सियस तक कम कर दिया जाता है, जिससे आगे के प्राइमर को इसके एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट के पूरक भाग में शामिल होने की अनुमति मिलती है।एनीलिंग तापमान सीधे प्राइमर की लंबाई और संरचना पर निर्भर करता है।

विस्तार चरण में, डीएनए पोलीमरेज़ एक नए डीएनए स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है जो डीएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड का पूरक है।प्रतिक्रिया मिश्रण से 5′से 3′दिशा में टेम्पलेट के पूरक मुक्त नाभिक जोड़कर।इस चरण का तापमान प्रयुक्त डीएनए पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है।

पहले चक्र के बाद, एक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए लक्ष्य प्राप्त होता है।

फिर, दूसरे चक्र में प्रवेश करें।डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को दो एकल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणुओं का उत्पादन करने के लिए विकृत किया जाता है।

अगले चरण में, प्रतिक्रिया तापमान कम कर दिया जाता है, प्राइमरों को प्रत्येक एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट से जोड़ दिया जाता है, और टाक-मैन जांच को लक्ष्य डीएनए के पूरक भाग से जोड़ दिया जाता है।

टैकमैन जांच में एक फ्लोरोफोर सहसंयोजक रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के 5′अंत से जुड़ा हुआ होता है।साइक्लर के प्रकाश स्रोत से उत्तेजित होने पर, फ्लोरोफोर प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है।इसके अलावा, जांच 3′अंत पर एक क्वेंचर से बनी है।रिपोर्टर जीन की क्वेंचर से निकटता प्रतिदीप्ति का पता लगाने से रोकती है।

विस्तार चरण में, डीएनए पोलीमरेज़ एक नए स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है।जब पोलीमरेज़ टैकमैन जांच तक पहुंचता है, तो इसकी अंतर्जात 5′न्यूक्लियस गतिविधि जांच को साफ कर देती है, जिससे डाई को क्वेंचर से अलग कर दिया जाता है।

पीसीआर के प्रत्येक चक्र के साथ, अधिक डाई अणु निकलते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संश्लेषित एम्प्लिकॉन की संख्या के अनुपात में प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होती है।

यह विधि नमूने में मौजूद किसी दिए गए अनुक्रम की संख्या का अनुमान लगाने की अनुमति देती है।प्रत्येक चक्र में डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टुकड़ों की संख्या दोगुनी हो जाती है।इसलिए, पीसीआर का उपयोग बहुत छोटे नमूनों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

फ्लोरोसेंट सिग्नल, टंगस्टन हैलोजन लैंप, उत्तेजना फिल्टर, रिफ्लेक्टर, लेंस, उत्सर्जन फिल्टर और चार्ज युग्मित डिवाइस-सीसीडी कैमरे को मापने के लिए।

चरण 4 पता लगाएं

फ्लोरोसेंट सिग्नल, टंगस्टन हैलोजन लैंप, उत्तेजना फिल्टर, रिफ्लेक्टर, लेंस, उत्सर्जन फिल्टर और चार्ज युग्मित डिवाइस-सीसीडी कैमरे को मापने के लिए।

लैंप से फ़िल्टर की गई रोशनी परावर्तक द्वारा प्रतिबिंबित होती है, कंडेनसर लेंस से गुजरती है, और प्रत्येक छेद के केंद्र पर केंद्रित होती है।फिर छेद से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति दर्पण से परावर्तित होती है, उत्सर्जन फिल्टर से होकर गुजरती है, और सीसीडी कैमरे द्वारा पता लगाई जाती है।प्रत्येक पीसीआर चक्र में, सीसीडी द्वारा स्व-उत्तेजित फ्लोरोफोर प्रकाश का पता लगाया जा सकता है।

यह कैप्चर की गई रोशनी को डिजिटल डेटा में परिवर्तित करता है।इस विधि को वास्तविक समय पीसीआर कहा जाता है, और यह पीसीआर प्रतिक्रिया की प्रगति की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है।