हर कोई क्यूआरटी-पीसीआर प्रयोग के सिद्धांत, प्राइमर डिजाइन, परिणाम व्याख्या आदि के बारे में बात कर रहा है, लेकिन मुझे लगता है कि मुझे आपके साथ क्यूआरटी-पीसीआर के प्रायोगिक संचालन को साझा करना चाहिए।यह छोटा है, लेकिन यह परिणामों के बारे में है।

क्यूआरटी-पीसीआर करने से पहले, हमें अपने स्वयं के आरएनए और ऑपरेशन विधियों की स्पष्ट समझ होनी चाहिए।आख़िरकार, हमारे प्रयासों का उद्देश्य केवल अभ्यास करना नहीं बल्कि परिणाम प्राप्त करना है।इसलिए क्यूआरटी-पीसीआर करने से पहले, हमें निम्नलिखित मुद्दों को निर्धारित करने की आवश्यकता है (जिनमें से कुछ केवल एसवाईबीआर पर लागू होते हैं)।

1 क्या आप आश्वस्त हैं कि आपका आरएनए ख़राब नहीं हुआ है?

नैनोड्रॉप 2000 केवल आरएनए की एकाग्रता और शुद्धता का पता लगा सकता है, लेकिन आरएनए की अखंडता का पता नहीं लगा सकता है।

आरएनए (आरएनए इंटेसिटी नंबर) मान आरएनए की अखंडता को प्रतिबिंबित कर सकता है, जिसे एगिलेंट 2100 बायोएनालाइज़र सिस्टम द्वारा पता लगाया जाता है।

चित्र: विभिन्न आरएनए नमूनों (यूकेरियोट्स) के लिए आरआईएन मूल्यों का योजनाबद्ध आरेख

हालाँकि, प्रयोगशालाओं में आमतौर पर एजिलेंट 2100 बायोएनालाइज़र नहीं होता है।इस मामले में, हम फॉर्मेल्डिहाइड जेल के माध्यम से पता लगा सकते हैं, लेकिन आरएनए की कुल मात्रा की आवश्यकता अधिक है, इसलिए सबसे तेज़ तरीका साधारण जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करना है।इसका न्यूक्लीज-मुक्त वातावरण में होना आवश्यक है, इसलिए इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक, सोल बोतल, जेल ब्रैकेट और कंघी को डीईपीसी पानी से धोना आवश्यक है।एगरोज़ न्यूक्लीज़-मुक्त भी है (जब तक इसे ताज़ा खोला जाता है), और लोडिंग बफ़र को 1.2% जेल के साथ, जितना संभव हो ताज़ा खोला जाना चाहिए।

ध्यान दें कि जेल पूरी तरह से घुल जाना चाहिए, अन्यथा यह अमानवीय बैंड का कारण बनेगा, जैसा कि चित्र में नमूना 9 में दिखाया गया है।यदि वोल्टेज बहुत अधिक है या बहुत लंबे समय तक चलने से गर्मी उत्पन्न होगी और आरएनए क्षरण होगा, इसलिए वोल्टेज और समय को उचित रूप से नियंत्रित किया जाना चाहिए।इसके अलावा, जेल चलाने से यह भी निर्धारित किया जा सकता है कि नमूने में डीएनए अवशेष है या नहीं, और निरीक्षण कर सकता है कि वितरण कुएं में बड़ी संख्या में बरकरार बैंड हैं या नहीं।

आकृति।आरएनए का जेल वैद्युतकणसंचलन पता लगाना

2 क्या आप अपने सीडीएनए की सांद्रता के बारे में निश्चित हैं?

प्रयोगशाला में बड़े भाइयों का अनुभव यह है कि प्रत्येक व्युत्क्रम द्वारा प्राप्त 20 उल प्रणाली का सीडीएनए सीधे 20X पतला होता है, जबकि पोस्ट-डॉक्टरल बहनों को 10X पतला किया जाता है।मैं आमतौर पर स्थिति पर निर्भर रहता हूं।क्योंकि प्रत्येक व्यक्ति द्वारा उल्लिखित आरएनए की गुणवत्ता अलग-अलग होती है, उत्क्रमण का स्तर भी भिन्न होता है, और उत्क्रमण तकनीक स्थिर नहीं हो सकती है।

इसलिए हर बार जब मुझे उलटा सीडीएनए मिलता है, तो मैं पहले इसे लगभग 3 बार पतला करूंगा, और फिर आरटी-पीसीआर करने के लिए हाउसकीपिंग जीन का उपयोग करूंगा, विशिष्ट एकाग्रता की पहचान करने के लिए चक्रों की संख्या आम तौर पर 25 चक्र होती है, और फिर अंतिम कमजोर पड़ने वाले कारक का निर्धारण करती है।

3 क्या आप आश्वस्त हैं कि आपके प्राइमर का उपयोग करना आसान है?

यह क्यूआरटी-पीसीआर के पिघलने वाले वक्र को पार कर सकता है, लेकिन इसमें अभी भी पैसा खर्च होता है।बहुत अधिक पैसे के बिना प्रयोगशालाओं के लिए, जब उन्हें बहुत सारे प्राइमर मिलते हैं, तो वे यह देखने के लिए साधारण आरटी-पीसीआर का उपयोग कर सकते हैं कि क्या यह एकल बैंड है और प्राइमर की विशिष्टता की पहचान कर सकते हैं।यदि प्रयोगशाला में पैसे की कमी नहीं है, तो सभी प्राइमरों की विशिष्टता को पिघलने वाले वक्र के माध्यम से एक बार पहचाना जा सकता है।

4 क्या आप आश्वस्त हैं कि आपकी प्रायोगिक स्थितियाँ उपयुक्त हैं?

SYBR को तेज़ रोशनी से बचाया जाना चाहिए, इसलिए SYBR अभिकर्मक जोड़ते समय ओवरहेड लाइट को बंद करने का प्रयास करें, और इसे पूरा करने के लिए केवल मंद रोशनी का उपयोग करने की आवश्यकता है।

SYBR को 4°C पर स्टोर करें।उपयोग करते समय, झाग से बचने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पलटें, और जोर से घुमाएँ नहीं।

कुछ छोटी बहनें नमूनों में गड़बड़ी के डर से पीसीआर बोर्ड पर निशान बनाना पसंद करती हैं, जो गलत है।चूँकि आपके मार्कर फ्लोरोसेंट सिग्नल के संग्रह को प्रभावित करने की बहुत अधिक संभावना रखते हैं, मैं आम तौर पर जूनियर्स को मेमोरी में सहायता के लिए प्रयोगात्मक नोटबुक का उपयोग करने की सलाह देता हूं, जैसा कि नीचे दिखाया गया है।

आकृति।क्यूआरटी-पीसीआर नमूना लोडिंग आरेख

5 क्या आप निश्चित हैं कि आप इसे सही कर रहे हैं?

दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें, दस्ताने पहनें, दस्ताने पहनें और महत्वपूर्ण बातें तीन बार कहें।

एसवाईबीआर के प्रकाश के संपर्क को कम करने के लिए, मैं व्यक्तिगत रूप से पहले एक टेम्पलेट जोड़ना पसंद करता हूं, जैसा कि नीचे दिए गए चित्र में दिखाया गया है।अनुभव के अनुसार, थोड़ी मात्रा में टेम्पलेट जोड़ने से नमूनाकरण त्रुटियाँ होने की संभावना है।इसलिए, थोड़ी मात्रा में टेम्प्लेट जोड़ने से होने वाली त्रुटि को कम करने के लिए, मैं आमतौर पर नमूने को दोबारा दोगुना कर देता हूं, और जोड़े गए H2O2 की मात्रा को कम करने के लिए नमूना जोड़ते समय मात्रा को दोगुना कर देता हूं।

आकृति।क्यूआरटी-पीसीआर लोडिंग का योजनाबद्ध आरेख

फिर क्यूआरटी-पीसीआर सिस्टम को निम्नानुसार कॉन्फ़िगर करें।

आकृति।क्यूआरटी-पीसीआर प्रणाली तैयारी आरेख

नोट: कॉन्फ़िगरेशन प्रक्रिया बर्फ पर की जानी चाहिए।

नमूना डालने के बाद पारदर्शी सीलिंग फिल्म चिपका दें।कोशिश करें कि पारदर्शी सीलिंग फिल्म की सतह को अपने हाथों से न छुएं, बस फिल्म के दोनों तरफ की जगह से काम करें।क्योंकि उंगलियों के निशान फ्लोरोसेंट सिग्नल के संग्रह को भी प्रभावित कर सकते हैं।फिर नमूने को दीवार पर लटकने से रोकने के लिए कम गति पर 10 सेकंड के लिए जल्दी से सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।

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