आरटी-क्यूपीसीआर को सामान्य पीसीआर तकनीक से विकसित किया गया है।यह पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में फ्लोरोसेंट रसायन (फ्लोरोसेंट डाई या फ्लोरोसेंट जांच) जोड़ता है, और उनके विभिन्न ल्यूमिनसेंट तंत्र के अनुसार वास्तविक समय में पीसीआर एनीलिंग और विस्तार प्रक्रिया का पता लगाता है।पीसीआर के प्रत्येक चक्र में उत्पाद परिवर्तन की मात्रा की गणना करने के लिए माध्यम में फ्लोरोसेंट सिग्नल परिवर्तन का उपयोग किया जाता है।वर्तमान में, सबसे आम विधियाँ फ्लोरोसेंट डाई विधि और जांच विधि हैं।

फ्लोरोसेंट डाई विधि:
कुछ फ्लोरोसेंट रंग, जैसे कि एसवाईबीआर ग्रीन Ⅰ, पिकोग्रीन, बीईबीओ इत्यादि, स्वयं प्रकाश उत्सर्जित नहीं करते हैं, लेकिन डीएसडीएनए के छोटे खांचे से जुड़ने के बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं।इसलिए, पीसीआर प्रतिक्रिया की शुरुआत में, मशीन फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता नहीं लगा सकती है।जब प्रतिक्रिया एनीलिंग-एक्सटेंशन (दो-चरण विधि) या विस्तार चरण (तीन-चरण विधि) तक आगे बढ़ती है, तो इस समय डबल स्ट्रैंड खुल जाते हैं, और नए डीएनए पोलीमरेज़ स्ट्रैंड संश्लेषण के दौरान, फ्लोरोसेंट अणु डीएसडीएनए माइनर ग्रूव में संयुक्त होते हैं और प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं।जैसे-जैसे पीसीआर चक्रों की संख्या बढ़ती है, अधिक से अधिक रंग डीएसडीएनए के साथ जुड़ते हैं, और फ्लोरोसेंट सिग्नल भी लगातार बढ़ाया जाता है।उदाहरण के तौर पर SYBR ग्रीन Ⅰ को लें।
जांच विधि:
टैक्मैन जांच सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली हाइड्रोलिसिस जांच है।जांच के 5′ सिरे पर एक फ्लोरोसेंट समूह होता है, आमतौर पर एफएएम।जांच स्वयं लक्ष्य जीन का पूरक अनुक्रम है।फ्लोरोफोर के 3′ सिरे पर एक फ्लोरोसेंट शमन समूह होता है।प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फोर्स्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण, एफआरईटी) के सिद्धांत के अनुसार, जब रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह (दाता फ्लोरोसेंट अणु) और शमन फ्लोरोसेंट समूह (स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट अणु) जब उत्तेजना स्पेक्ट्रम ओवरलैप होता है और दूरी बहुत करीब (7-10 एनएम) होती है, तो दाता अणु की उत्तेजना स्वीकर्ता अणु की प्रतिदीप्ति को प्रेरित कर सकती है, जबकि ऑटोफ्लोरेसेंस कमजोर हो जाता है।इसलिए, पीसीआर प्रतिक्रिया की शुरुआत में, जब जांच सिस्टम में स्वतंत्र और बरकरार है, तो रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह फ्लोरोसेंस उत्सर्जित नहीं करेगा।एनीलिंग करते समय, प्राइमर और प्रोब टेम्पलेट से जुड़ जाते हैं।विस्तार चरण के दौरान, पोलीमरेज़ लगातार नई श्रृंखलाओं का संश्लेषण करता है।डीएनए पोलीमरेज़ में 5′-3′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि होती है।जांच तक पहुंचने पर, डीएनए पोलीमरेज़ टेम्पलेट से जांच को हाइड्रोलाइज करेगा, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह को क्वेंचर फ्लोरोसेंट समूह से अलग करेगा, और फ्लोरोसेंट सिग्नल जारी करेगा।चूंकि जांच और टेम्पलेट के बीच एक-से-एक संबंध है, इसलिए परीक्षण की सटीकता और संवेदनशीलता के मामले में जांच विधि डाई विधि से बेहतर है।

चित्र 1 क्यूआरटी-पीसीआर का सिद्धांत

प्राइमर डिज़ाइन
सिद्धांतों:

प्राइमरों को न्यूक्लिक एसिड श्रृंखला के संरक्षित क्षेत्र में डिज़ाइन किया जाना चाहिए और उनमें विशिष्टता होनी चाहिए।

सीडीएनए अनुक्रम का उपयोग करना सबसे अच्छा है, और एमआरएनए अनुक्रम भी स्वीकार्य है।यदि नहीं, तो डीएनए अनुक्रम के सीडी क्षेत्र डिज़ाइन का पता लगाएं।
फ्लोरोसेंट मात्रात्मक उत्पाद की लंबाई 80-150बीपी है, सबसे लंबी 300बीपी है, प्राइमर की लंबाई आम तौर पर 17-25 बेस के बीच है, और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर के बीच का अंतर बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए।

G+C सामग्री 40% से 60% के बीच है, और 45-55% सर्वोत्तम है।
टीएम मान 58-62 डिग्री के बीच है।
प्राइमर डिमर्स और सेल्फ-डिमर्स से बचने की कोशिश करें, (लगातार पूरक आधारों के 4 जोड़े से अधिक दिखाई न दें) हेयरपिन संरचना, यदि अपरिहार्य हो, तो ΔG<4.5kJ/mol* बनाएं यदि आप यह सुनिश्चित नहीं कर सकते हैं कि जीडीएनए को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्लीन के दौरान हटा दिया गया है, तो इंट्रॉन के प्राइमरों को डिजाइन करना सबसे अच्छा है *3′ अंत को संशोधित नहीं किया जा सकता है, और एटी, जीसी समृद्ध क्षेत्रों से बचने के लिए, टी/सी, ए/जी निरंतर संरचना (2-3) से बचें। प्राइमर और गैर-
विशिष्ट विषम प्रवर्धित अनुक्रम की समरूपता अधिमानतः 70% से कम है या इसमें 8 पूरक आधार समरूपता है।
डेटाबेस:
कीवर्ड द्वारा कॉटनएफजीडी खोज
प्राइमर डिज़ाइन:
आईडीटी-क्यूपीसीआर प्राइमर डिज़ाइन

Fig2 IDT ऑनलाइन प्राइमर डिज़ाइन टूल पेज

चित्र 3 परिणाम पृष्ठ प्रदर्शन
एलएनसीआरएनए प्राइमरों का डिज़ाइन:
एलएनसीआरएनए:एमआरएनए के समान चरण।
miRNA:स्टेम-लूप विधि का सिद्धांत: चूंकि सभी miRNAs लगभग 23 एनटी के छोटे अनुक्रम हैं, प्रत्यक्ष पीसीआर का पता नहीं लगाया जा सकता है, इसलिए स्टेम-लूप अनुक्रम उपकरण का उपयोग किया जाता है।स्टेम-लूप अनुक्रम लगभग 50 एनटी का एकल-फंसे डीएनए है, जो स्वयं एक हेयरपिन संरचना बना सकता है।3 'अंत को miRNA आंशिक टुकड़े के पूरक अनुक्रम के रूप में डिज़ाइन किया जा सकता है, फिर लक्ष्य miRNA को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के दौरान स्टेम-लूप अनुक्रम से जोड़ा जा सकता है, और कुल लंबाई 70bp तक पहुंच सकती है, जो qपीसीआर द्वारा निर्धारित प्रवर्धित उत्पाद की लंबाई के अनुरूप है।टेलिंग miRNA प्राइमर डिज़ाइन।
प्रवर्धन-विशिष्ट पहचान:
ऑनलाइन ब्लास्ट डेटाबेस: अनुक्रम समानता द्वारा कॉटनएफजीडी ब्लास्ट
स्थानीय विस्फोट: स्थानीय विस्फोट करने के लिए ब्लास्ट + का उपयोग करने का संदर्भ लें, लिनक्स और मैकोज़ सीधे स्थानीय डेटाबेस स्थापित कर सकते हैं, उबंटू बैश स्थापित करने के बाद Win10 सिस्टम भी किया जा सकता है।स्थानीय ब्लास्ट डेटाबेस और स्थानीय ब्लास्ट बनाएं;Win10 पर उबंटू बैश खोलें।
सूचना: अपलैंड कपास और समुद्री द्वीप कपास टेट्राप्लोइड फसलें हैं, इसलिए विस्फोट का परिणाम अक्सर दो या दो से अधिक मैच होगा।अतीत में, विस्फोट करने के लिए डेटाबेस के रूप में एनएयू सीडी का उपयोग करने से केवल कुछ एसएनपी अंतर के साथ दो समजात जीन मिलने की संभावना है।आमतौर पर, दो समजात जीनों को प्राइमर डिज़ाइन द्वारा अलग नहीं किया जा सकता है, इसलिए उन्हें एक ही माना जाता है।यदि कोई स्पष्ट इंडेल है, तो प्राइमर आमतौर पर इंडेल पर डिज़ाइन किया जाता है, लेकिन इससे प्राइमर की द्वितीयक संरचना हो सकती है। मुक्त ऊर्जा अधिक हो जाती है, जिससे प्रवर्धन दक्षता में कमी आती है, लेकिन यह अपरिहार्य है।

प्राइमर माध्यमिक संरचना का पता लगाना:
कदम:ऑलिगो 7 खोलें → इनपुट टेम्प्लेट अनुक्रम → उप-विंडो बंद करें → सहेजें → टेम्प्लेट पर प्राइमर का पता लगाएं, प्राइमर की लंबाई निर्धारित करने के लिए Ctrl+D दबाएं → विभिन्न माध्यमिक संरचनाओं का विश्लेषण करें, जैसे सेल्फ-डिमराइजेशन बॉडी, हेटेरोडिमर, हेयरपिन, मिसमैच, आदि। चित्र 4 में अंतिम दो चित्र प्राइमर के परीक्षण परिणाम हैं।फ्रंट प्राइमर का परिणाम अच्छा है, इसमें कोई स्पष्ट डिमर और हेयरपिन संरचना नहीं है, कोई निरंतर पूरक आधार नहीं है, और मुक्त ऊर्जा का पूर्ण मूल्य 4.5 से कम है, जबकि पिछला प्राइमर निरंतर दिखाता है 6 आधार पूरक हैं, और मुक्त ऊर्जा 8.8 है;इसके अलावा, 3′ सिरे पर एक अधिक गंभीर डिमर दिखाई देता है, और लगातार 4 आधारों का डिमर दिखाई देता है।यद्यपि मुक्त ऊर्जा अधिक नहीं है, 3′ डिमर सीएचएल प्रवर्धन विशिष्टता और प्रवर्धन दक्षता को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकता है।इसके अलावा, हेयरपिन, हेटेरोडिमर्स और बेमेल की जांच करना आवश्यक है।

चित्र 3 ओलिगो 7 का पता लगाने के परिणाम
प्रवर्धन दक्षता का पता लगाना:
पीसीआर प्रतिक्रिया की प्रवर्धन दक्षता पीसीआर परिणामों को गंभीरता से प्रभावित करती है।इसके अलावा क्यूआरटी-पीसीआर में, मात्रात्मक परिणामों के लिए प्रवर्धन दक्षता विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।प्रतिक्रिया बफर में अन्य पदार्थों, मशीनों और प्रोटोकॉल को हटा दें।क्यूआरटी-पीसीआर की प्रवर्धन दक्षता पर प्राइमरों की गुणवत्ता का भी काफी प्रभाव पड़ता है।परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, सापेक्ष प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव और पूर्ण प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव दोनों को प्राइमरों की प्रवर्धन दक्षता का पता लगाने की आवश्यकता है।यह माना जाता है कि प्रभावी क्यूआरटी-पीसीआर प्रवर्धन दक्षता 85% और 115% के बीच है।दो विधियाँ हैं:
1. मानक वक्र विधि:
एक।सीडीएनए मिलाएं
बी।धीरे-धीरे कमजोर पड़ना
सी.क्यूपीसीआर
डी।प्रवर्धन दक्षता की गणना के लिए रैखिक प्रतिगमन समीकरण
2. लिनरेगपीसीआर
LinRegपीसीआर वास्तविक समय आरटी-पीसीआर डेटा के विश्लेषण के लिए एक कार्यक्रम है, जिसे एसवाईबीआर ग्रीन या इसी तरह के रसायन विज्ञान पर आधारित मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) डेटा भी कहा जाता है।प्रोग्राम गैर-बेसलाइन सही डेटा का उपयोग करता है, प्रत्येक नमूने पर बेसलाइन सुधार अलग से करता है, एक विंडो-ऑफ़-रैखिकता निर्धारित करता है और फिर पीसीआर डेटा सेट के माध्यम से एक सीधी रेखा फिट करने के लिए रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करता है।इस रेखा के ढलान से प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने की पीसीआर दक्षता की गणना की जाती है।प्रति एम्प्लिकॉन औसत पीसीआर दक्षता और प्रति नमूना सीटी मान का उपयोग प्रति नमूना प्रारंभिक एकाग्रता की गणना करने के लिए किया जाता है, जो मनमानी प्रतिदीप्ति इकाइयों में व्यक्त किया जाता है।डेटा इनपुट और आउटपुट एक्सेल स्प्रेडशीट के माध्यम से होते हैं।केवल नमूना
मिश्रण की आवश्यकता है, कोई ढाल नहीं
कदम आवश्यक हैं:(उदाहरण के तौर पर बोले सीएफएक्स96 को लें, स्पष्ट एबीआई वाली बिल्कुल मशीन नहीं)
प्रयोग:यह एक मानक क्यूपीसीआर प्रयोग है।
क्यूपीसीआर डेटा आउटपुट:LinRegपीसीआर आउटपुट फ़ाइलों के दो रूपों को पहचान सकता है: आरडीएमएल या परिमाणीकरण प्रवर्धन परिणाम।वास्तव में, यह मशीन द्वारा चक्र संख्या और प्रतिदीप्ति संकेत का वास्तविक समय का पता लगाने वाला मूल्य है, और रैखिक खंड दक्षता के प्रतिदीप्ति परिवर्तन मूल्य का विश्लेषण करके प्रवर्धन प्राप्त किया जाता है।
डेटा चयन: सिद्धांत रूप में, आरडीएमएल मान प्रयोग योग्य होना चाहिए।यह अनुमान लगाया गया है कि मेरे कंप्यूटर की समस्या यह है कि सॉफ़्टवेयर आरडीएमएल को नहीं पहचान सकता है, इसलिए मेरे पास मूल डेटा के रूप में एक्सेल आउटपुट मान है।पहले डेटा की रफ स्क्रीनिंग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे नमूने जोड़ने में विफलता आदि। आउटपुट डेटा में बिंदुओं को हटाया जा सकता है (बेशक, आप उन्हें हटा नहीं सकते हैं, LinRegपीसीआर बाद के चरण में इन बिंदुओं को अनदेखा कर देगा)

चित्र5 क्यूपीसीआर डेटा निर्यात

चित्र6 उम्मीदवार के नमूनों का चयन

डेटा इनपुट:योग्यता प्रवर्धन परिणाम खोलें।

लिनरेगपीसीआर डेटा इनपुट के चित्र 7 चरण

परिणाम:यदि कोई दोहराव नहीं है, तो किसी समूहीकरण की आवश्यकता नहीं है।यदि पुनरावृत्ति होती है, तो समूहीकरण को नमूना समूहन में संपादित किया जा सकता है, और जीन का नाम पहचानकर्ता में दर्ज किया जाता है, और फिर वही जीन स्वचालित रूप से समूहीकृत हो जाएगा।अंत में, फ़ाइल पर क्लिक करें, एक्सेल निर्यात करें और परिणाम देखें।प्रत्येक कुएं की प्रवर्धन दक्षता और R2 परिणाम प्रदर्शित किए जाएंगे।दूसरे, यदि आप समूहों में विभाजित करते हैं, तो सही औसत प्रवर्धन दक्षता प्रदर्शित की जाएगी।सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्राइमर की प्रवर्धन दक्षता 85% और 115% के बीच है।यदि यह बहुत बड़ा या बहुत छोटा है, तो इसका मतलब है कि प्राइमर की प्रवर्धन दक्षता खराब है।

चित्र 8 परिणाम और डेटा आउटपुट

प्रायोगिक प्रक्रिया:
आरएनए गुणवत्ता आवश्यकताएँ:
शुद्धता:1.72.0 इंगित करता है कि अवशिष्ट आइसोथियोसाइनेट हो सकता है।स्वच्छ न्यूक्लिक एसिड A260/A230 लगभग 2 होना चाहिए। यदि 230 एनएम पर एक मजबूत अवशोषण होता है, तो यह इंगित करता है कि इसमें फ़िनेट आयन जैसे कार्बनिक यौगिक हैं।इसके अलावा, 1.5% एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा इसका पता लगाया जा सकता है।मार्कर को इंगित करें, क्योंकि ssRNA में कोई विकृतीकरण नहीं है और आणविक भार लघुगणक का रैखिक संबंध नहीं है, और आणविक भार को सही ढंग से व्यक्त नहीं किया जा सकता है।एकाग्रता: सैद्धांतिक रूप सेनहीं100ng/ul से कम, यदि सांद्रता बहुत कम है, तो शुद्धता आम तौर पर कम होती है, अधिक नहीं

चित्र9 आरएनए जेल

इसके अलावा, यदि नमूना कीमती है और आरएनए सांद्रता अधिक है, तो निष्कर्षण के बाद इसे अलग करने की सिफारिश की जाती है, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए आरएनए को 100-300ng/ul की अंतिम सांद्रता तक पतला कर दिया जाता है।मेंरिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन की प्रक्रिया, जब एमआरएनए ट्रांसक्राइब किया जाता है, तो ऑलिगो (डीटी) प्राइमर जो विशेष रूप से पॉलीए टेल्स से जुड़ सकते हैं, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयोग किए जाते हैं, जबकि एलएनसीआरएनए और सर्आरएनए कुल आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए रैंडम हेक्सामर (रैंडम 6 मेर) प्राइमर का उपयोग करते हैं। miRNA के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए miRNA- विशिष्ट नेक-लूप प्राइमर का उपयोग किया जाता है।कई कंपनियों ने अब स्पेशल टेलिंग किट लॉन्च कर दी हैं।स्टेम-लूप विधि के लिए, टेलिंग विधि अधिक सुविधाजनक, उच्च-थ्रूपुट और अभिकर्मक-बचत है, लेकिन एक ही परिवार के miRNAs को अलग करने का प्रभाव स्टेम-लूप विधि जितना अच्छा नहीं होना चाहिए।प्रत्येक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट में जीन-विशिष्ट प्राइमरों (स्टेम-लूप) की एकाग्रता की आवश्यकताएं होती हैं।miRNA के लिए प्रयुक्त आंतरिक संदर्भ U6 है।स्टेम-लूप उलटा की प्रक्रिया में, U6 की एक ट्यूब को अलग से उलटा किया जाना चाहिए, और U6 के सामने और पीछे के प्राइमर को सीधे जोड़ा जाना चाहिए।circRNA और lncRNA दोनों HKGs को आंतरिक संदर्भ के रूप में उपयोग कर सकते हैं।मेंसीडीएनए का पता लगाना,
यदि आरएनए में कोई समस्या नहीं है, तो सीडीएनए भी ठीक होना चाहिए।हालाँकि, यदि प्रयोग की पूर्णता का पीछा किया जाता है, तो आंतरिक संदर्भ जीन (संदर्भ जीन, आरजी) का उपयोग करना सबसे अच्छा है जो सीडीएनए को सीडीएनए से अलग कर सकता है।आम तौर पर, आरजी एक हाउसकीपिंग जीन है।, एचकेजी) जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है;उस समय, मैं सोयाबीन भंडारण प्रोटीन बना रहा था, और आंतरिक संदर्भ के रूप में एक्टिन7 युक्त इंट्रॉन का उपयोग किया था।जीडीएनए में इस प्राइमर के प्रवर्धित टुकड़े का आकार 452bp था, और यदि सीडीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता था, तो यह 142bp था।फिर परीक्षण के परिणामों से पता चला कि सीडीएनए का एक हिस्सा वास्तव में जीडीएनए द्वारा दूषित था, और यह भी साबित हुआ कि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के परिणाम में कोई समस्या नहीं थी, और इसे पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस को सीधे सीडीएनए के साथ चलाना बेकार है, और यह एक फैला हुआ बैंड है, जो आश्वस्त करने वाला नहीं है।

चित्र 10 सीडीएनए का पता लगाना

क्यूपीसीआर स्थितियों का निर्धारणकिट के प्रोटोकॉल के अनुसार आम तौर पर कोई समस्या नहीं है, मुख्यतः टीएम मान के चरण में।यदि प्राइमर डिज़ाइन के दौरान कुछ प्राइमर अच्छी तरह से डिज़ाइन नहीं किए गए हैं, जिसके परिणामस्वरूप टीएम मान और सैद्धांतिक 60 डिग्री सेल्सियस के बीच बड़ा अंतर होता है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि सीडीएनए नमूने मिश्रित होने के बाद, प्राइमर के साथ एक ग्रेडिएंट पीसीआर चलाएं, और टीएम मान के रूप में बैंड के बिना तापमान सेट करने से बचने का प्रयास करें।

डेटा विश्लेषण

पारंपरिक सापेक्ष प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रसंस्करण विधि मूल रूप से 2 के अनुसार है-ΔΔCT.डाटा प्रोसेसिंग टेम्पलेट.

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