प्रयोगशाला में एक नए के रूप में, कम रूपांतरण दर वाले पौधों के समूह से सकारात्मक पौधों को बाहर निकालना अच्छा काम नहीं है।सबसे पहले, डीएनए को एक-एक करके बड़ी संख्या में नमूनों से निकाला जाना चाहिए, और फिर पीसीआर द्वारा विदेशी जीन का पता लगाया जाएगा।हालाँकि, परिणाम अक्सर रिक्त होते हैं और कभी-कभी कुछ वस्तुओं के साथ बैंड होते हैं, लेकिन यह निर्धारित करना असंभव है कि क्या गलत पहचान हुई हैं या गलत पहचान हुई हैं।.क्या ऐसी प्रायोगिक प्रक्रिया और परिणामों का सामना करना बहुत असहाय है?चिंता न करें, भाई आपको सिखाता है कि ट्रांसजेनिक सकारात्मक पौधों को आसानी से और सटीक तरीके से कैसे छांटना है।

स्टेप 1

डिज़ाइन डिटेक्शन प्राइमर

परीक्षण किए जाने वाले नमूने के अनुसार पता लगाए जाने वाले अंतर्जात जीन और बहिर्जात जीन का निर्धारण करें, और प्राइमर डिज़ाइन के लिए जीन में एक प्रतिनिधि 100-500bp अनुक्रम का चयन करें।अच्छे प्राइमर डिटेक्शन परिणामों की सटीकता सुनिश्चित कर सकते हैं और डिटेक्शन समय को कम कर सकते हैं (आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले डिटेक्शन प्राइमर के लिए परिशिष्ट देखें)।

सूचना: नए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों को प्रतिक्रिया स्थितियों को अनुकूलित करने और बड़े पैमाने पर पता लगाने से पहले पता लगाने की सटीकता, परिशुद्धता और पता लगाने की सीमा को सत्यापित करने की आवश्यकता है।

चरण दो

प्रायोगिक प्रोटोकॉल डिज़ाइन करें

सकारात्मक नियंत्रण: पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली और स्थितियाँ सामान्य हैं या नहीं यह निर्धारित करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य टुकड़े वाले शुद्ध डीएनए का उपयोग करें।

नकारात्मक/रिक्त नियंत्रण: पीसीआर प्रणाली में संदूषण का कोई स्रोत है या नहीं, इसका पता लगाने के लिए टेम्पलेट के रूप में डीएनए टेम्पलेट या डीडीएच2ओ का उपयोग करें जिसमें लक्ष्य टुकड़ा शामिल नहीं है।

आंतरिक संदर्भ नियंत्रण: पीसीआर द्वारा टेम्पलेट का पता लगाया जा सकता है या नहीं इसका मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किए जाने वाले नमूने के अंतर्जात जीन के प्राइमर/जांच संयोजन का उपयोग करें।

सूचना:

प्रयोगात्मक परिणामों की वैधता का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक परीक्षण के लिए सकारात्मक, नकारात्मक/रिक्त नियंत्रण और आंतरिक नियंत्रण नियंत्रण निर्धारित किए जाने चाहिए।

प्रयोग की तैयारी

उपयोग से पहले, देखें कि घोल समान रूप से मिश्रित है या नहीं।यदि वर्षा पाई जाती है, तो इसे उपयोग से पहले निर्देशों के अनुसार घोलने और मिश्रित करने की आवश्यकता होती है।असमान आयन वितरण से बचने के लिए उपयोग से पहले 2×पीसीआर मिश्रण को बार-बार पिपेट और माइक्रोपिपेट के साथ मिश्रित करने की आवश्यकता होती है।

सूचना:

मैनुअल निकालें और इसे ध्यान से पढ़ें, और मैनुअल की आवश्यकताओं के अनुसार सख्ती से प्रयोग से पहले तैयारी करें।

चरण 4

पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें

प्रायोगिक प्रोटोकॉल के अनुसार, प्राइमर, एच2ओ और 2×पीसीआर मिश्रण को समान रूप से मिलाएं, सेंट्रीफ्यूज करें और उन्हें प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब में वितरित करें।

सूचना:

बड़े पैमाने पर या दीर्घकालिक परीक्षण के लिए, यूएनजी एंजाइम युक्त पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जो पीसीआर उत्पादों के कारण होने वाले एयरोसोल संदूषण से प्रभावी ढंग से बच सकती है।

चरण 5

प्रतिक्रिया टेम्पलेट जोड़ें

डायरेक्ट पीसीआर तकनीक का उपयोग करते हुए, थकाऊ न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण प्रक्रिया की कोई आवश्यकता नहीं है, नमूना टेम्पलेट 10 मिनट के भीतर तैयार किया जा सकता है, और संबंधित पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली को जोड़ा जा सकता है।

सूचना:

दरार विधि का बेहतर पहचान प्रभाव होता है, और प्राप्त उत्पाद का उपयोग कई पहचान प्रतिक्रियाओं के लिए किया जा सकता है।

5.1: पत्तियों का सीधा विस्तार

मैनुअल में चित्र के आकार के अनुसार, पत्ती के ऊतक को 2-3 मिमी व्यास में काटें और इसे पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में रखें।

नोट: सुनिश्चित करें कि पत्ती के टुकड़े पूरी तरह से पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान में डूबे हुए हैं, और अत्यधिक पत्ती ऊतक न जोड़ें।

5.2: पत्ती विभाजन विधि

पत्ती के ऊतक को 5-7 मिमी व्यास में काटें और इसे एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।यदि आप परिपक्व पत्तियां चुनते हैं, तो कृपया पत्ती की मुख्य शिरा के ऊतकों का उपयोग करने से बचें।यह सुनिश्चित करने के लिए कि लाइसेट पत्ती के ऊतकों को पूरी तरह से डुबो सके, पिपेट 50ul बफर पी1 को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, इसे थर्मल साइक्लर या मेटल बाथ में रखें और 5-10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर लाइसेट करें।

50ul बफर पी2 न्यूट्रलाइजेशन घोल डालें और अच्छी तरह मिलाएँ।परिणामी लाइसेट को एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है और पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में जोड़ा जा सकता है।

नोट: टेम्प्लेट की मात्रा पीसीआर सिस्टम के 5-10% के बीच है, और 20% से अधिक नहीं होनी चाहिए (उदाहरण के लिए, 20μl पीसीआर सिस्टम में, 1-2μl लाइसिस समाधान जोड़ें, 4μl से अधिक नहीं)।

चरण 6

पीसीआर प्रतिक्रिया

पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, इसे प्रवर्धन के लिए पीसीआर उपकरण में रखा जाता है।

सूचना:

प्रतिक्रिया प्रवर्धन के लिए गैर-शुद्ध टेम्पलेट का उपयोग करती है, इसलिए शुद्ध डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करने की तुलना में प्रवर्धन चक्रों की संख्या 5-10 चक्र अधिक है।

चरण 7

वैद्युतकणसंचलन का पता लगाना और परिणाम विश्लेषण

एम: 100बीपी डीएनए सीढ़ी

1\4: शुद्ध डीएनए विधि

2\5: प्रत्यक्ष पीसीआर विधि

3\6: रिक्त नियंत्रण

क्यूसी:

प्रयोग में निर्धारित विभिन्न नियंत्रणों के परीक्षण परिणाम निम्नलिखित शर्तों को पूरा करने चाहिए।अन्यथा, समस्या के कारण का विश्लेषण किया जाना चाहिए, और समस्या समाप्त होने के बाद परीक्षण दोबारा किया जाना चाहिए।

तालिका 1. विभिन्न नियंत्रण समूहों के सामान्य परीक्षण परिणाम

*जब प्लास्मिड का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है, तो अंतर्जात जीन परीक्षण परिणाम नकारात्मक हो सकता है

परिणाम निर्णय:

A. नमूने के अंतर्जात जीन का परीक्षण परिणाम नकारात्मक है, जो दर्शाता है कि सामान्य पीसीआर पहचान के लिए उपयुक्त डीएनए को नमूने से नहीं निकाला जा सकता है या निकाले गए डीएनए में पीसीआर प्रतिक्रिया अवरोधक होते हैं, और डीएनए को फिर से निकाला जाना चाहिए।

बी. नमूने के अंतर्जात जीन का परीक्षण परिणाम सकारात्मक है, और बहिर्जात जीन का परीक्षण परिणाम नकारात्मक है, यह दर्शाता है कि साधारण पीसीआर पहचान के लिए उपयुक्त डीएनए नमूने से निकाला गया है, और यह अनुमान लगाया जा सकता है कि नमूने में XXX जीन का पता नहीं चला है।

सी. नमूने के अंतर्जात जीन का परीक्षण परिणाम सकारात्मक है, और बहिर्जात जीन का परीक्षण परिणाम सकारात्मक है, यह दर्शाता है कि सामान्य पीसीआर पहचान के लिए उपयुक्त डीएनए नमूने से निकाला गया है, और नमूना डीएनए में XXX जीन शामिल है।पुष्टिकरण प्रयोग आगे भी किये जा सकते हैं।

चरण 8

डिज़ाइन डिटेक्शन प्राइमर

प्रयोग के बाद, पर्यावरण प्रदूषण को रोकने के लिए प्रयोगात्मक क्षेत्र को पोंछने के लिए 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल और 70% इथेनॉल घोल का उपयोग करें।