一,प्रतिक्रिया प्रणाली की संवेदनशीलता बढ़ाएँ：

1. उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को अलग करें：

सफल सीडीएनए संश्लेषण उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए से होता है।उच्च-गुणवत्ता वाला आरएनए कम से कम पूर्ण-लंबाई वाला होना चाहिए और ईडीटीए या एसडीएस जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अवरोधकों से मुक्त होना चाहिए।आरएनए की गुणवत्ता अनुक्रम जानकारी की अधिकतम मात्रा निर्धारित करती है जिसे आप सीडीएनए में स्थानांतरित कर सकते हैं।एक सामान्य आरएनए शुद्धिकरण विधि गुआनिडीन आइसोथियोसाइनेट/एसिड फिनोल का उपयोग करके एक-चरणीय विधि है।RNase की सूक्ष्म मात्रा द्वारा संदूषण को रोकने के लिए, RNase-समृद्ध नमूनों (जैसे अग्न्याशय) से पृथक RNA को उच्च गुणवत्ता वाले RNA को संरक्षित करने के लिए, विशेष रूप से दीर्घकालिक भंडारण के लिए, फॉर्मेल्डिहाइड में संग्रहित करने की आवश्यकता होती है।चूहे के जिगर से निकाला गया आरएनए एक सप्ताह तक पानी में रखने के बाद मूल रूप से नष्ट हो गया था, जबकि चूहे की तिल्ली से निकाला गया आरएनए 3 साल तक पानी में रखने के बाद स्थिर रहा।इसके अलावा, 4 केबी से अधिक लंबे ट्रांसक्रिप्ट छोटे ट्रांसक्रिप्ट की तुलना में ट्रेस आरएनएएस द्वारा गिरावट के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं।संग्रहीत आरएनए नमूनों की स्थिरता बढ़ाने के लिए, आरएनए को विआयनीकृत फॉर्मामाइड में भंग किया जा सकता है और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।आरएनए को संरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला फॉर्मामाइड आरएनए-विघटनकारी मलबे से मुक्त होना चाहिए।अग्न्याशय से आरएनए को फॉर्मामाइड में कम से कम एक वर्ष तक संरक्षित किया जा सकता है।आरएनए का उपयोग करने की तैयारी करते समय, आप आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए निम्नलिखित विधि का उपयोग कर सकते हैं: NaCl को 0.2M और इथेनॉल की 4 गुना मात्रा में जोड़ें, कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट के लिए रखें, और 5 मिनट के लिए 10,000×g पर सेंट्रीफ्यूज करें।

2. RNaseH-निष्क्रिय (RNaseH-) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करें：

सीडीएनए संश्लेषण की लंबाई और उपज बढ़ाने के लिए RNase अवरोधकों को अक्सर रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में जोड़ा जाता है।RNase अवरोधकों को बफर और एक कम करने वाले एजेंट (जैसे DTT) की उपस्थिति में प्रथम-स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया के दौरान जोड़ा जाना चाहिए, क्योंकि cDNA संश्लेषण से पहले की प्रक्रिया अवरोधक को विकृत कर देती है, जिससे बाध्य RNase जारी होता है जो RNA को ख़राब कर सकता है।प्रोटीन RNase अवरोधक केवल RNase A, B, C द्वारा RNA के क्षरण को रोकते हैं, और त्वचा पर RNase को नहीं रोकते हैं, इसलिए सावधान रहें कि इन अवरोधकों के उपयोग के बावजूद अपनी उंगलियों से RNase को न डालें।

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आरएनए के सीडीएनए में रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है।एम-एमएलवी और एएमवी दोनों में अपनी पोलीमरेज़ गतिविधि के अलावा अंतर्जात RNaseH गतिविधि होती है।आरएनएएसईएच गतिविधि और पोलीमरेज़ गतिविधि आरएनए टेम्पलेट और डीएनए प्राइमर या सीडीएनए एक्सटेंशन स्ट्रैंड के बीच गठित हाइब्रिड स्ट्रैंड के लिए एक दूसरे के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं, और आरएनए: डीएनए कॉम्प्लेक्स में आरएनए स्ट्रैंड को नीचा दिखाते हैं।RNaseH गतिविधि द्वारा अपमानित आरएनए टेम्पलेट अब सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक प्रभावी सब्सट्रेट के रूप में काम नहीं कर सकता है, जो सीडीएनए संश्लेषण की उपज और लंबाई को कम कर देता है।इसलिए, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की RNaseH गतिविधि को खत्म करना या बहुत कम करना फायदेमंद होगा।。

सुपरस्क्रिप्ट Ⅱ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, RNaseH- MMLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और थर्मोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, RNaseH- AMV, MMLV और AMV की तुलना में अधिक मात्रा और अधिक पूर्ण लंबाई वाला सीडीएनए प्राप्त कर सकते हैं।आरटी-पीसीआर संवेदनशीलता सीडीएनए संश्लेषण की मात्रा से प्रभावित होगी।थर्मोस्क्रिप्ट एएमवी से कहीं अधिक संवेदनशील है।आरटी-पीसीआर उत्पादों का आकार सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की क्षमता से सीमित है, खासकर जब बड़े सीडीएनए की क्लोनिंग की जाती है।एमएमएलवी की तुलना में, सुपरस्क्रिपⅡ ने लंबे आरटी-पीसीआर उत्पादों की उपज में उल्लेखनीय वृद्धि की।RNaseH-रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस ने थर्मोस्टेबिलिटी में भी वृद्धि की है, इसलिए प्रतिक्रिया सामान्य 37-42°C से अधिक तापमान पर की जा सकती है।सुझाई गई संश्लेषण शर्तों के तहत, ऑलिगो(डीटी) प्राइमर और [α-P]dCTP के 10 μCi का उपयोग करें।पहले स्ट्रैंड की कुल उपज की गणना टीसीए अवक्षेपण विधि का उपयोग करके की गई थी।पूर्ण-लंबाई वाले सीडीएनए का विश्लेषण आकार-क्रमबद्ध बैंडों का उपयोग करके किया गया था, जिन्हें क्षारीय एगरोज़ जेल पर काटा और गिना गया था।

3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए ऊष्मायन तापमान बढ़ाएं：

एक उच्च ऊष्मायन तापमान आरएनए माध्यमिक संरचना को खोलने में मदद करता है, जिससे प्रतिक्रिया की उपज बढ़ जाती है।अधिकांश आरएनए टेम्पलेट्स के लिए, आरएनए और प्राइमरों को बफर या नमक के बिना 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के बाद बर्फ पर तेजी से ठंडा करने से अधिकांश माध्यमिक संरचनाएं खत्म हो जाएंगी और प्राइमरों को बांधने की अनुमति मिल जाएगी।हालाँकि, ऊष्मा विकृतीकरण के बाद भी, कुछ टेम्प्लेट में अभी भी द्वितीयक संरचनाएँ होती हैं।इन कठिन टेम्पलेट्स का प्रवर्धन थर्मोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके और प्रवर्धन में सुधार के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया को उच्च तापमान पर रखकर किया जा सकता है।उच्च ऊष्मायन तापमान भी विशिष्टता बढ़ा सकता है, खासकर जब जीन-विशिष्ट प्राइमर (जीएसपी) का उपयोग सीडीएनए संश्लेषण के लिए किया जाता है (अध्याय 3 देखें)।यदि जीएसपी का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि प्राइमरों का टीएम अपेक्षित ऊष्मायन तापमान के समान है।60°C से ऊपर ऑलिगो(डीटी) और रैंडम प्राइमर का उपयोग न करें।रैंडम प्राइमर को 60°C तक बढ़ाने से पहले 10 मिनट के लिए 25°C पर ऊष्मायन की आवश्यकता होती है।उच्च रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन तापमान का उपयोग करने के अलावा, आरएनए/प्राइमर मिश्रण को 65 डिग्री सेल्सियस विकृतीकरण तापमान से सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ऊष्मायन तापमान में स्थानांतरित करके और पूर्व-गर्म 2 × प्रतिक्रिया मिश्रण (सीडीएनए हॉट-स्टार्ट संश्लेषण) जोड़कर विशिष्टता में भी सुधार किया जा सकता है।यह दृष्टिकोण कम तापमान पर होने वाले अंतर-आणविक आधार युग्मन को रोकने में मदद करता है।आरटी-पीसीआर के लिए आवश्यक एकाधिक तापमान स्विचिंग को थर्मल साइक्लर का उपयोग करके सरल बनाया जा सकता है।

Tth थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ Mg2+ की उपस्थिति में डीएनए पोलीमरेज़ के रूप में और Mn2+ की उपस्थिति में RNA पोलीमरेज़ के रूप में कार्य करता है।इसे अधिकतम 65°C तापमान पर गर्म रखा जा सकता है।हालाँकि, पीसीआर के दौरान एमएन2+ की उपस्थिति निष्ठा को कम कर देती है, जो टीटीएच पोलीमरेज़ को उच्च-परिशुद्धता प्रवर्धन, जैसे सीडीएनए की क्लोनिंग के लिए कम उपयुक्त बनाती है।इसके अलावा, टीटीएच में कम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता है, जो संवेदनशीलता को कम करती है, और, चूंकि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर को एक ही एंजाइम के साथ किया जा सकता है, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बिना नियंत्रण प्रतिक्रियाओं का उपयोग दूषित जीनोमिक डीएनए के साथ सीडीएनए प्रवर्धन उत्पादों की तुलना करने के लिए नहीं किया जा सकता है।प्रवर्धन उत्पादों को अलग कर दिया गया।

4. योजक जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देते हैं：

ग्लिसरॉल और डीएमएसओ सहित एडिटिव्स को पहले-स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है, जो न्यूक्लिक एसिड डबल-स्ट्रैंड की स्थिरता को कम कर सकता है और आरएनए की माध्यमिक संरचना को खोल सकता है।सुपरस्क्रिप्ट II या एमएमएलवी गतिविधि को प्रभावित किए बिना 20% ग्लिसरॉल या 10% डीएमएसओ तक जोड़ा जा सकता है।एएमवी गतिविधि को खोए बिना 20% तक ग्लिसरॉल को भी सहन कर सकता है।सुपरस्क्रिप्टⅡ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में आरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता को अधिकतम करने के लिए, 10% ग्लिसरॉल जोड़ा जा सकता है और 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जा सकता है।यदि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया उत्पाद का 1/10 भाग पीसीआर में जोड़ा जाता है, तो प्रवर्धन प्रतिक्रिया में ग्लिसरॉल की एकाग्रता 0.4% है, जो पीसीआर को बाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है।

5. RNaseH उपचार：

पीसीआर से पहले आरएनएएसईएच के साथ सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियाओं का उपचार संवेदनशीलता बढ़ा सकता है।कुछ टेम्पलेट्स के लिए, यह माना जाता है कि सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया में आरएनए प्रवर्धन उत्पादों के बंधन को रोकता है, इस स्थिति में आरएनएएसएच उपचार संवेदनशीलता बढ़ा सकता है।आम तौर पर, RNaseH उपचार आवश्यक होता है जब लंबे पूर्ण-लंबाई वाले सीडीएनए लक्ष्य टेम्पलेट्स को बढ़ाया जाता है, जैसे कि कम-कॉपी ट्यूबरस शेरोसिस II।इस कठिन टेम्पलेट के लिए, RNaseH उपचार ने सुपरस्क्रिप्ट II या AMV-संश्लेषित सीडीएनए द्वारा उत्पादित सिग्नल को बढ़ाया।अधिकांश आरटी-पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए, आरएनएएसईएच उपचार वैकल्पिक है, क्योंकि 95 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर विकृतीकरण चरण आम तौर पर आरएनए: डीएनए कॉम्प्लेक्स में आरएनए को हाइड्रोलाइज करता है।

6. छोटे आरएनए जांच विधि में सुधार：

आरटी-पीसीआर विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है जब आरएनए की केवल थोड़ी मात्रा उपलब्ध होती है।आरएनए अलगाव के दौरान वाहक के रूप में जोड़ा गया ग्लाइकोजन छोटे नमूनों की उपज बढ़ाने में मदद करता है।RNase-मुक्त ग्लाइकोजन को ट्राइज़ोल मिलाने के साथ ही जोड़ा जा सकता है।ग्लाइकोजन पानी में घुलनशील है और बाद में वर्षा में सहायता के लिए इसे आरएनए के साथ जलीय चरण में रखा जा सकता है।50 मिलीग्राम से कम ऊतक या 106 संवर्धित कोशिकाओं के नमूनों के लिए, RNase मुक्त ग्लाइकोजन की अनुशंसित सांद्रता 250 μg/ml है।

सुपरस्क्रिप्ट II का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया में एसिटिलेटेड बीएसए जोड़ने से संवेदनशीलता बढ़ सकती है, और आरएनए की छोटी मात्रा के लिए, सुपरस्क्रिप्ट II की मात्रा कम हो सकती है और RNaseOut न्यूक्लियस अवरोधक की 40 इकाइयों को जोड़ने से पता लगाने का स्तर बढ़ सकता है।यदि आरएनए अलगाव प्रक्रिया में ग्लाइकोजन का उपयोग किया जाता है, तो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए सुपरस्क्रिप्ट II का उपयोग करते समय बीएसए या आरएनएएस अवरोधक जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

二、आरटी-पीसीआर विशिष्टता बढ़ाएँ

1. सीएनडी असिंथेसिस：

प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके शुरू किया जा सकता है, जिसकी सापेक्ष विशिष्टता संश्लेषित सीडीएनए की मात्रा और प्रकार को प्रभावित करती है।

यादृच्छिक प्राइमर विधि तीन विधियों में से सबसे कम विशिष्ट थी।प्राइमर पूरे प्रतिलेख में कई साइटों पर स्थापित होते हैं, जिससे लघु, आंशिक-लंबाई वाले सीडीएनए उत्पन्न होते हैं।इस पद्धति का उपयोग अक्सर 5′ अंत अनुक्रम प्राप्त करने और माध्यमिक संरचना के क्षेत्रों या समाप्ति साइटों वाले आरएनए टेम्पलेट्स से सीडीएनए प्राप्त करने के लिए किया जाता है जिन्हें रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा दोहराया नहीं जा सकता है।सबसे लंबी सीडीएनए प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक आरएनए नमूने में प्राइमर और आरएनए का अनुपात अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है।यादृच्छिक प्राइमरों की प्रारंभिक सांद्रता 50 से 250 एनजी प्रति 20 μl प्रतिक्रिया तक थी।चूंकि यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करके कुल आरएनए से संश्लेषित सीडीएनए मुख्य रूप से राइबोसोमल आरएनए है, पॉली (ए) + आरएनए को आम तौर पर टेम्पलेट के रूप में चुना जाता है।

ओलिगो (डीटी) प्राइमर यादृच्छिक प्राइमरों की तुलना में अधिक विशिष्ट होते हैं।यह अधिकांश यूकेरियोटिक एमआरएनए के 3′ सिरे पर पाई जाने वाली पॉली(ए) पूंछ में संकरण करता है।क्योंकि पॉली(ए)+ आरएनए कुल आरएनए का लगभग 1% से 2% है, सीडीएनए की मात्रा और जटिलता यादृच्छिक प्राइमरों की तुलना में बहुत कम है।इसकी उच्च विशिष्टता के कारण, ऑलिगो (डीटी) को आम तौर पर प्राइमर और पॉली (ए) + चयन के लिए आरएनए के अनुपात के अनुकूलन की आवश्यकता नहीं होती है।प्रति 20μl प्रतिक्रिया प्रणाली में 0.5μg ओलिगो (dT) का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।ऑलिगो(डीटी)12-18 अधिकांश आरटी-पीसीआर के लिए उपयुक्त है।थर्मोस्क्रिप्ट आरटी-पीसीआर सिस्टम उच्च ऊष्मायन तापमान के लिए बेहतर थर्मल स्थिरता के कारण ऑलिगो (डीटी) 20 प्रदान करता है।

जीन विशिष्ट प्राइमर (जीएसपी) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण के लिए सबसे विशिष्ट प्राइमर हैं।जीएसपी एक एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड है जो यादृच्छिक प्राइमरों या ऑलिगो (डीटी) के विपरीत, विशेष रूप से आरएनए लक्ष्य अनुक्रम में संकरण कर सकता है, जो सभी आरएनए को जोड़ता है।पीसीआर प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वही नियम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में जीएसपी के डिजाइन पर लागू होते हैं।जीएसपी एम्प्लीफिकेशन प्राइमर के समान अनुक्रम हो सकता है जो एमआरएनए के 3′-सबसे अंत तक जुड़ा होता है, या जीएसपी को रिवर्स एम्प्लीफिकेशन प्राइमर के डाउनस्ट्रीम को एनील करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है।कुछ प्रवर्धित विषयों के लिए, सफल आरटी-पीसीआर के लिए एक से अधिक एंटीसेंस प्राइमर को डिज़ाइन करने की आवश्यकता होती है क्योंकि लक्ष्य आरएनए की द्वितीयक संरचना प्राइमर बाइंडिंग को रोक सकती है।20 μl प्रथम-स्ट्रैंड संश्लेषण प्रतिक्रिया में 1 pmol एंटीसेंस GSP का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।

2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए ऊष्मायन तापमान बढ़ाएं：

जीएसपी विशिष्टता का पूरा लाभ उठाने के लिए, उच्च थर्मोस्टेबिलिटी वाले रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाना चाहिए।प्रतिक्रिया कठोरता को बढ़ाने के लिए थर्मोस्टेबल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को उच्च तापमान पर ऊष्मायन किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, यदि कोई जीएसपी 55 डिग्री सेल्सियस पर समाप्त हो जाता है, तो जीएसपी की विशिष्टता का पूरी तरह से उपयोग नहीं किया जाएगा यदि एएमवी या एम-एमएलवी का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस की कम कठोरता पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए किया जाता है।हालाँकि, सुपरस्क्रिप्ट II और थर्मोस्क्रिप्ट को 50°C या इससे अधिक तापमान पर प्रतिक्रिया दी जा सकती है, जो कम तापमान पर उत्पन्न होने वाले गैर-विशिष्ट उत्पादों को खत्म कर देगा।अधिकतम विशिष्टता के लिए, आरएनए/प्राइमर मिश्रण को सीधे 65 डिग्री सेल्सियस विकृतीकरण तापमान से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ऊष्मायन तापमान में स्थानांतरित किया जा सकता है और पूर्व-गर्म 2× प्रतिक्रिया मिश्रण (सीडीएनए संश्लेषण हॉट स्टार्ट) में जोड़ा जा सकता है।यह कम तापमान पर अंतरआणविक आधार युग्मन को रोकने में मदद करता है।आरटी-पीसीआर के लिए आवश्यक कई तापमान बदलावों को थर्मल साइक्लर का उपयोग करके सरल बनाया जा सकता है।

3. जीनोमिक डीएनए संदूषण को कम करता है：

आरटी-पीसीआर के साथ आने वाली एक संभावित कठिनाई आरएनए में जीनोमिक डीएनए का संदूषण है।ट्राइज़ोल रिएजेंट जैसी एक अच्छी आरएनए अलगाव विधि का उपयोग करने से आरएनए तैयारी को दूषित करने वाले जीनोमिक डीएनए की मात्रा कम हो जाएगी।जीनोमिक डीएनए से प्राप्त उत्पादों से बचने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले दूषित डीएनए को हटाने के लिए आरएनए को प्रवर्धन-ग्रेड DNase I के साथ इलाज किया जा सकता है।DNase I पाचन को 65°C पर 10 मिनट के लिए 2.0 mM EDTA में नमूनों को इनक्यूबेट करके समाप्त किया गया था।EDTA उच्च तापमान पर मैग्नीशियम आयन-निर्भर आरएनए हाइड्रोलिसिस को रोकते हुए, मैग्नीशियम आयनों को केलेट कर सकता है।

प्रवर्धित सीडीएनए को दूषित जीनोमिक डीएनए प्रवर्धन उत्पादों से अलग करने के लिए, प्राइमरों को डिज़ाइन किया जा सकता है ताकि प्रत्येक एक्सॉन को अलग कर सके।सीडीएनए से प्राप्त पीसीआर उत्पाद दूषित जीनोमिक डीएनए से प्राप्त उत्पादों की तुलना में छोटे होंगे।इसके अलावा, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या दिया गया टुकड़ा जीनोमिक डीएनए या सीडीएनए से प्राप्त किया गया था, प्रत्येक आरएनए टेम्पलेट पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बिना एक नियंत्रण प्रयोग किया गया था।रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बिना प्राप्त पीसीआर उत्पाद जीनोम से प्राप्त होता है।