Ⅰ. प्रतिक्रिया प्रणाली की संवेदनशीलता बढ़ाएँ:

1. उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को अलग करें:

सफल सीडीएनए संश्लेषण उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए से होता है।उच्च-गुणवत्ता वाले आरएनए को कम से कम लंबे समय तक सुनिश्चित करना चाहिए और इसमें ऐसे अवरोधक शामिल नहीं होने चाहिए जिनमें ईडीटीए या एसडीएस जैसे रिकॉर्डिंग एंजाइम शामिल न हों।आरएनए की गुणवत्ता उस अनुक्रम जानकारी का अधिकतम मूल्य निर्धारित करती है जिसे आप सीडीएनए में स्थानांतरित कर सकते हैं।सामान्य आरएनए शुद्धिकरण विधि आइसोसाइनेट/एसिडोफेनोल का उपयोग करने की एक चरणबद्ध विधि है।RNase के प्रदूषण को रोकने के लिए, RNase (जैसे अग्न्याशय) से समृद्ध नमूने से अलग किए गए RNA को उच्च गुणवत्ता वाले RNA को बचाने के लिए फॉर्मेल्डिहाइड के भंडारण की आवश्यकता होती है, जो दीर्घकालिक भंडारण के लिए और भी अधिक है।चूहे के जिगर से निकाला गया आरएनए पानी में एक सप्ताह के भंडारण के बाद मूल रूप से नष्ट हो गया था, जबकि चूहे की तिल्ली से निकाला गया आरएनए पानी में तीन साल तक भंडारण के बाद स्थिर रहा।इसके अलावा, 4kb से बड़े ट्रांसक्रिप्ट छोटे ट्रांसक्रिप्ट की तुलना में RNase गिरावट का पता लगाने के लिए अधिक संवेदनशील होते हैं।भंडारण आरएनए नमूने की स्थिरता को बढ़ाने के लिए, आरएनए को आयन के मेथल्ममाइन में भंग किया जा सकता है, और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।आरएनए को बचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले थाइलाइड में आरएनए को ख़राब करने वाली विविध वस्तु नहीं होनी चाहिए।आरएनए, जो अग्न्याशय से प्राप्त होता है, को मेथल्ममाइन में कम से कम एक वर्ष तक संग्रहीत किया जा सकता है।जब आप आरएनए का उपयोग करने के लिए तैयार हों, तो आप आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए निम्नलिखित तरीकों का उपयोग कर सकते हैं: 0.2 मीटर और इथेनॉल की 4 गुना मात्रा में NaCl जोड़ें, 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें, और 5 मिनट के लिए 10,000 × जी केन्द्रापसारक रखें।

2. RNaseH गतिविधि के बिना रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करें (RNaseH-)：

सीडीएनए संश्लेषण की लंबाई और उपज बढ़ाने के लिए RNase अवरोधकों को अक्सर रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में जोड़ा जाता है।RNase अवरोधक को बफ़र्स और DTT जैसे कम करने वाले एजेंटों की उपस्थिति में पहली श्रृंखला संश्लेषण प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है क्योंकि प्री-सीडीएनए संश्लेषण प्रक्रिया अवरोधक को विकृत कर देती है, जिससे आरएनए को ख़राब करने वाले बाध्य RNase जारी होते हैं।प्रोटीन RNase अवरोधक केवल RNase A, B, C द्वारा RNA के क्षरण को रोकता है, और त्वचा पर RNase को नहीं रोकता है, इसलिए इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि इन अवरोधकों के उपयोग के बावजूद उंगलियों से RNase का प्रवेश न हो।

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आरएनए के सीडीएनए में रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है।एम-एमएलवी और एएमवी दोनों में अपनी पोलीमरेज़ गतिविधि के अलावा अंतर्जात RNaseH गतिविधि होती है।RNaseH गतिविधि आरएनए टेम्पलेट्स और डीएनए प्राइमरों या सीडीएनए एक्सटेंशन स्ट्रैंड्स के बीच गठित विषमयुग्मजी स्ट्रैंड्स के लिए पोलीमरेज़ गतिविधि के साथ प्रतिस्पर्धा करती है, और डीएनए कॉम्प्लेक्स में आरएनए: आरएनए स्ट्रैंड्स को नीचा दिखाती है।RNaseH गतिविधि द्वारा अपमानित आरएनए टेम्पलेट्स को अब सीडीएनए संश्लेषण के लिए प्रभावी सब्सट्रेट के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है, जिससे सीडीएनए संश्लेषण की उपज और लंबाई कम हो जाती है।इस प्रकार रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की RNaseH गतिविधि को समाप्त करने या बहुत कम करने से बहुत लाभ होगा।

सुपरस्क्रिप्टⅡ रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़, RNaseH- का MMLV रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ और थर्मोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़, RNaseH- का AMV, MMLV और AMV की तुलना में अधिक पूर्ण-लंबाई वाला सीडीएनए उत्पन्न करता है।आरटी-पीसीआर संवेदनशीलता संश्लेषित सीडीएनए की मात्रा से प्रभावित होती है।थर्मोस्क्रिप्ट एएमवी से कहीं अधिक संवेदनशील है।आरटी-पीसीआर उत्पादों का आकार सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की क्षमता से सीमित है, खासकर जब बड़े सीडीएनए की क्लोनिंग की जाती है।एमएमएलवी की तुलना में, सुपरस्क्रिपⅡ ने लंबे आरटी-पीसीआर उत्पादों की उपज में उल्लेखनीय वृद्धि की।RNaseH- का रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस थर्मल स्थिरता को भी बढ़ाता है, इसलिए प्रतिक्रिया सामान्य 37-42℃ से अधिक तापमान पर की जा सकती है।सुझाई गई संश्लेषण शर्तों के तहत, ऑलिगो (डीटी) प्राइमर और 10μCi [अल्फा-पी] डीसीटीपी का उपयोग किया गया था।पहली श्रृंखला के कुल उत्पादन की गणना टीसीए अवक्षेपण विधि का उपयोग करके की गई थी।आकार-क्रमबद्ध पट्टी को हटाने और एक क्षारीय एगरोज़ जेल में गिनती का उपयोग करके पूर्ण लंबाई सीडीएनए का विश्लेषण किया गया था।

3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का ताप संरक्षण तापमान बढ़ाएँ：

उच्च धारण तापमान आरएनए की द्वितीयक संरचना को खोलने और प्रतिक्रिया की उपज को बढ़ाने में मदद करता है।अधिकांश आरएनए टेम्प्लेट के लिए, आरएनए और प्राइमर को बफर या नमक के बिना 65°C पर रखने और फिर उन्हें बर्फ पर जल्दी से ठंडा करने से अधिकांश माध्यमिक संरचनाएं समाप्त हो जाती हैं और प्राइमर को बांधने की अनुमति मिलती है।हालाँकि, थर्मल विकृतीकरण के बाद भी कुछ टेम्प्लेट में अभी भी द्वितीयक संरचना होती है।इन कठिन टेम्पलेट्स का प्रवर्धन थर्मोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करके और प्रवर्धन में सुधार के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रिया को उच्च तापमान पर रखकर किया जा सकता है।उच्च धारण तापमान भी विशिष्टता बढ़ा सकता है, खासकर जब सीडीएनए संश्लेषण जीन-विशिष्ट प्राइमरों (जीएसपीएस) का उपयोग करके किया जाता है (अध्याय 3 देखें)।यदि जीएसपी का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि प्राइमर का टीएम मान अपेक्षित होल्डिंग तापमान के समान है।60℃ से ऊपर ऑलिगो(डीटी) और रैंडम प्राइमर का उपयोग न करें।रैंडम प्राइमर को 60℃ तक बढ़ाने से पहले 10 मिनट के लिए 25℃ पर रखना होगा।उच्च रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन तापमान का उपयोग करने के अलावा, आरएनए/प्राइमर मिश्रण को 65℃ विकृत तापमान से सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन होल्डिंग तापमान में स्थानांतरित करके और पहले से गरम 2× प्रतिक्रिया मिश्रण (सीडीएनए थर्मल दीक्षा संश्लेषण) जोड़कर विशिष्टता में सुधार किया जा सकता है।यह दृष्टिकोण कम तापमान पर होने वाले अंतर-आणविक आधार युग्मन को रोकने में मदद करता है।पीसीआर उपकरण का उपयोग आरटी-पीसीआर के लिए आवश्यक कई तापमान स्विच को सरल बनाता है।

Tth ऊष्मा स्थिरीकृत पोलीमरेज़ Mg2+ की उपस्थिति में DNA पोलीमरेज़ और Mn2+ की उपस्थिति में RNA पोलीमरेज़ के रूप में कार्य करता है।यह 65℃ तक गर्मी बरकरार रख सकता है।हालाँकि, पीसीआर के दौरान एमएन2+ की उपस्थिति निष्ठा को कम कर देती है, जो टीटीएच पोलीमरेज़ को उच्च परिशुद्धता प्रवर्धन, जैसे सीडीएनए क्लोनिंग के लिए कम उपयुक्त बनाती है।इसके अलावा, टीटीएच रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में कम कुशल है, जो संवेदनशीलता को कम करता है, और चूंकि एक ही एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर कर सकता है, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बिना नियंत्रण प्रतिक्रियाओं का उपयोग सीडीएनए के प्रवर्धित उत्पादों को दूषित जीनोमिक डीएनए से अलग करने के लिए नहीं किया जा सकता है।

4. योजक जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देता है：

पहली श्रृंखला संश्लेषण प्रतिक्रिया में ग्लिसरीन और डीएमएसओ सहित एडिटिव्स को शामिल करने से न्यूक्लिक एसिड डबल स्ट्रैंड की स्थिरता कम हो सकती है और आरएनए माध्यमिक संरचना को खोल दिया जा सकता है।सुपरस्क्रिप्टⅡ या एमएमएलवी की गतिविधि को प्रभावित किए बिना 20% ग्लिसरीन या 10% डीएमएसओ जोड़ा जा सकता है।एएमवी गतिविधि को कम किए बिना 20% तक ग्लिसरॉल को भी सहन कर सकता है।सुपरस्क्रिप्टⅡ रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्रतिक्रिया में आरटी-पीसीआर की संवेदनशीलता को अधिकतम करने के लिए, 10% ग्लिसरॉल जोड़ा जा सकता है और 45℃ पर इन्सुलेट किया जा सकता है।यदि रेट्रोट्रांसक्रिप्शन-प्रतिक्रिया उत्पाद का 1/10 पीसीआर में जोड़ा जाता है, तो प्रवर्धन प्रतिक्रिया में ग्लिसरॉल की एकाग्रता 0.4% है, जो पीसीआर को बाधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है।

5. RNaseH प्रसंस्करण：

पीसीआर से पहले आरएनएएसईएच के साथ सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियाओं का इलाज करके संवेदनशीलता में सुधार किया जा सकता है।कुछ टेम्पलेट्स के लिए, यह माना जाता है कि सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया में आरएनए प्रवर्धित उत्पादों के बंधन को रोकता है, इस स्थिति में आरएनएएसएच उपचार संवेदनशीलता बढ़ा सकता है।आम तौर पर, अपेक्षाकृत लंबे पूर्ण-लंबाई वाले सीडीएनए लक्ष्य टेम्पलेट के प्रवर्धन के लिए RNaseH उपचार की आवश्यकता होती है, जैसे कि कम प्रतिलिपि के साथ ट्यूबरस शेरोसिसⅡ।इस कठिन टेम्पलेट के लिए, RNaseH ने सुपरस्क्रिप्टⅡ या AMV द्वारा संश्लेषित सीडीएनए द्वारा उत्पन्न सिग्नल को बढ़ाया।अधिकांश आरटी-पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए, आरएनएएसईएच उपचार वैकल्पिक है क्योंकि 95℃ इंसुलेटेड पीसीआर विकृतीकरण चरण आमतौर पर आरएनए: डीएनए कॉम्प्लेक्स से आरएनए को हाइड्रोलाइज करता है।

6. आरएनए की छोटी मात्रा का पता लगाने के लिए बेहतर तरीके：

आरटी-पीसीआर विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है जब आरएनए की केवल थोड़ी मात्रा उपलब्ध होती है।आरएनए पृथक्करण के दौरान वाहक के रूप में ग्लाइकोजन को जोड़ने से छोटे नमूनों की उपज बढ़ाने में मदद मिलती है।एक RNase-मुक्त ग्लाइकोजन को ट्राइज़ोल के साथ ही जोड़ा जा सकता है।ग्लाइकोजन पानी में घुलनशील है और बाद में वर्षा में सहायता के लिए आरएनए के साथ जल चरण में रह सकता है।50 मिलीग्राम से कम ऊतक या 106 संवर्धित कोशिकाओं के नमूनों के लिए RNase-मुक्त ग्लाइकोजन की अनुशंसित सांद्रता 250μg/ml है।

सुपरस्क्रिप्टⅡ का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में एसिटिलेटेड बीएसए को जोड़ने से संवेदनशीलता बढ़ सकती है, और आरएनए की छोटी मात्रा के लिए, सुपरस्क्रिप्टⅡ की मात्रा कम हो सकती है और RnaseOut न्यूक्लियस अवरोधक की 40 इकाइयों को जोड़ने से पता लगाने के स्तर में सुधार हो सकता है।यदि आरएनए पृथक्करण में ग्लाइकोजन का उपयोग किया जाता है, तो सुपरस्क्रिप्टⅡ का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं के लिए बीएसए या आरएनएएस अवरोधकों को जोड़ने की अभी भी सिफारिश की जाती है।

Ⅱ. आरटी-पीसीआर की विशिष्टता बढ़ाएँ

1. सीएनडीए संश्लेषण：

पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण शुरू करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, और प्रत्येक विधि की सापेक्ष विशिष्टता संश्लेषित सीडीएनए की मात्रा और प्रकार को प्रभावित करती है।

रैंडम प्राइमर विधि तीन विधियों में से सबसे कम विशिष्ट है।छोटी, आंशिक लंबाई वाली सीडीएनए तैयार करने के लिए प्रतिलेख में कई साइटों पर प्राइमर लगाए जाते हैं।इस पद्धति का उपयोग अक्सर द्वितीयक संरचनात्मक क्षेत्रों के साथ या समापन साइटों के साथ आरएनए टेम्पलेट्स से 5′ टर्मिनल अनुक्रम और सीडीएनए प्राप्त करने के लिए किया जाता है जो रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को दोहरा नहीं सकते हैं।सबसे लंबी सीडीएनए प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक आरएनए नमूने में प्राइमर और आरएनए का अनुपात अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है।यादृच्छिक प्राइमरों की प्रारंभिक सांद्रता 50 से 250ng प्रति 20μl प्रतिक्रिया प्रणाली तक होती है।क्योंकि यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करके कुल आरएनए से संश्लेषित सीडीएनए मुख्य रूप से राइबोसोमल आरएनए है, पॉली (ए) + आरएनए को आम तौर पर टेम्पलेट के रूप में चुना जाता है।

ओलिगो (डीटी) दीक्षा यादृच्छिक प्राइमरों की तुलना में अधिक विशिष्ट है।यह अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एमआरएनए के 3′ सिरे पर पाई जाने वाली पॉली(ए) पूंछ के साथ संकरण करता है।क्योंकि पॉली(ए)+आरएनए कुल आरएनए का लगभग 1% से 2% है, सीडीएनए की मात्रा और जटिलता यादृच्छिक प्राइमर का उपयोग करने की तुलना में बहुत कम है।इसकी उच्च विशिष्टता के कारण, ऑलिगो (डीटी) को आम तौर पर आरएनए से प्राइमर अनुपात और पॉली (ए) + चयन के लिए अनुकूलन की आवश्यकता नहीं होती है।प्रति 20μl प्रतिक्रिया प्रणाली में 0.5μg ओलिगो (dT) का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।ऑलिगो(डीटी)12-18 अधिकांश आरटी-पीसीआर के लिए उपयुक्त है।थर्मोस्क्रिप्ट आरटी-पीसीआर सिस्टम अपनी अच्छी तापीय स्थिरता के कारण ऑलिगो (डीटी)20 प्रदान करता है और उच्च तापमान धारण के लिए उपयुक्त है।

जीन-विशिष्ट प्राइमर (जीएसपी) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण के लिए सर्वोत्तम विशिष्ट प्राइमर हैं।जीएसपी एक एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोसाइड है जो यादृच्छिक प्राइमर या ऑलिगो (डीटी) जैसे सभी आरएनए को खत्म करने के बजाय विशेष रूप से आरएनए गंतव्य अनुक्रमों के साथ संकरण कर सकता है।पीसीआर प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नियम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया जीएसपी के डिजाइन पर भी लागू होते हैं।जीएसपी वही अनुक्रम हो सकता है जो एमआरएनए3′ के अंत में एनील्ड किए गए एम्प्लीफिकेशन प्राइमर के समान होता है, या जीएसपी को रिवर्स एम्प्लीफिकेशन प्राइमर के साथ डाउनस्ट्रीम में एनील्ड करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है।कुछ प्रवर्धित वस्तुओं के लिए, सफल आरटी-पीसीआर के लिए एक से अधिक एंटीसेंस प्राइमर डिजाइन करना आवश्यक है क्योंकि लक्ष्य आरएनए की द्वितीयक संरचना प्राइमर को बंधन से रोक सकती है।20μl की पहली श्रृंखला संश्लेषण प्रतिक्रिया प्रणाली में 1pmol एंटीसेंस GSP का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है।

2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का ताप संरक्षण तापमान बढ़ाएँ：

जीएसपी विशिष्टता का पूरा लाभ उठाने के लिए, उच्च तापीय स्थिरता वाले रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग किया जाना चाहिए।प्रतिक्रिया कठोरता को बढ़ाने के लिए हीट-स्टेबल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को उच्च तापमान पर इन्सुलेट किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, यदि एक जीएसपी को 55 डिग्री सेल्सियस पर एनील्ड किया जाता है, तो जीएसपी की विशिष्टता का पूरी तरह से उपयोग नहीं किया जाता है यदि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन 37 डिग्री सेल्सियस पर एएमवी या एम-एमएलवी का उपयोग करके कम कठोरता के साथ किया जाता है।हालाँकि, सुपरस्क्रिपⅡ और थर्मोस्क्रिप्ट 50℃ या इससे अधिक पर प्रतिक्रिया कर सकते हैं, जो कम तापमान पर उत्पादित गैर-विशिष्ट उत्पादों को समाप्त कर देता है।अधिकतम विशिष्टता के लिए, आरएनए/प्राइमर मिश्रण को पहले से गरम 2x प्रतिक्रिया मिश्रण (सीडीएनए संश्लेषण की थर्मल शुरुआत) के साथ 65℃ विकृतीकरण तापमान से सीधे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन होल्डिंग तापमान में स्थानांतरित किया जा सकता है।यह कम तापमान पर अणुओं के बीच आधार युग्मन को रोकने में मदद करता है।पीसीआर उपकरण का उपयोग आरटी-पीसीआर के लिए आवश्यक कई तापमान संक्रमणों को सरल बनाता है।

3. जीनोमिक डीएनए संदूषण को कम करें：

आरटी-पीसीआर के साथ एक संभावित कठिनाई यह है कि आरएनए जीनोमिक डीएनए को दूषित कर देता है।ट्राइज़ोल रिएजेंट जैसे बेहतर आरएनए पृथक्करण तरीकों का उपयोग, आरएनए तैयारियों में जीनोमिक डीएनए संदूषण को कम करता है।जीनोमिक डीएनए से उत्पन्न उत्पादों से बचने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले दूषित डीएनए को हटाने के लिए आरएनए को प्रवर्धन ग्रेड डीएनएसⅠ के साथ इलाज किया जा सकता है।DNaseⅠ पाचन को समाप्त करने के लिए नमूनों को 10 मिनट के लिए 2.0 मिमी EDTA में 65℃ पर रखा गया था।EDTA उच्च तापमान पर होने वाले मैग्नीशियम आयन पर निर्भर आरएनए हाइड्रोलिसिस को रोकने के लिए मैग्नीशियम आयनों को केलेट करता है।

जीनोम डीएनए प्रवर्धन उत्पाद से प्रवर्धित सीडीएनए को अलग करने के लिए, अलग किए गए एक्सॉन के साथ अलग से जुड़ने वाले प्राइमरों को डिज़ाइन किया जा सकता है।सीडीएनए से प्राप्त पीसीआर उत्पाद दूषित जीनोमिक डीएनए से प्राप्त उत्पादों की तुलना में छोटे होंगे।यह निर्धारित करने के लिए कि कोई दिया गया टुकड़ा जीनोमिक डीएनए या सीडीएनए से है, प्रत्येक आरएनए टेम्पलेट पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बिना एक नियंत्रित प्रयोग भी किया जाता है।रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन के अभाव में प्राप्त पीसीआर उत्पाद जीनोम से प्राप्त होते हैं।

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