1. बुनियादी ज्ञान (यदि आप प्रायोगिक भाग देखना चाहते हैं, तो कृपया सीधे दूसरे भाग में स्थानांतरित करें)

पारंपरिक पीसीआर की व्युत्पन्न प्रतिक्रिया के रूप में, वास्तविक समय पीसीआर मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति संकेत के परिवर्तन के माध्यम से वास्तविक समय में पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के प्रत्येक चक्र में प्रवर्धन उत्पाद की मात्रा में परिवर्तन की निगरानी करता है, और सीटी मान और मानक वक्र के बीच संबंध के माध्यम से प्रारंभिक टेम्पलेट का मात्रात्मक विश्लेषण करता है।

आरटी-पीसीआर के विशिष्ट डेटा हैंआधारभूत, प्रतिदीप्ति सीमाऔरसीटी मान.

आरटी-पीसीआर के लिए सामान्य लेबलिंग विधियां:

2. प्रायोगिक चरण

2.1 प्रायोगिक समूहन के बारे में- समूह में कई कुएं होने चाहिए, और जैविक पुनरावृत्ति होनी चाहिए।

2.2 प्राइमर डिज़ाइन के सिद्धांत

①SiRNA प्रजाति-विशिष्ट है, और विभिन्न प्रजातियों का क्रम अलग-अलग होगा।

②SiRNA को फ्रीज-सूखे पाउडर में पैक किया जाता है, जिसे कमरे के तापमान पर 2-4 सप्ताह तक स्थिर रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।

2.3 उपकरण या अभिकर्मक जिन्हें पहले से तैयार करने की आवश्यकता है

2.4 उन मुद्दों के संबंध में जिन पर विशिष्ट प्रायोगिक चरणों में ध्यान देने की आवश्यकता है:

①siRNA अभिकर्मक प्रक्रिया

1. चढ़ाना के लिए, आप 24-वेल प्लेट, 12-वेल प्लेट या 6-वेल प्लेट चुन सकते हैं (24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्रस्तावित औसत आरएनए एकाग्रता लगभग 100-300 एनजी/यूएल है), और कोशिकाओं का इष्टतम अभिकर्मक घनत्व 60% -80% या उससे भी अधिक है

2. अभिकर्मक चरण और विशिष्ट आवश्यकताएं सख्ती से निर्देशों के अनुसार हैं।

3. ट्रांसफ़ेक्शन के बाद, एमआरएनए डिटेक्शन (आरटी-पीसीआर) के लिए 24-72 घंटों के भीतर या 48-96 घंटों (डब्ल्यूबी) के भीतर प्रोटीन डिटेक्शन के लिए नमूने एकत्र किए जा सकते हैं।

② आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया

1. बहिर्जात एंजाइमों द्वारा संदूषण को रोकें।इसमें मुख्य रूप से मास्क और दस्ताने सख्ती से पहनना शामिल है;निष्फल पिपेट युक्तियों और ईपी ट्यूबों का उपयोग करना;प्रयोग में प्रयुक्त पानी RNase-मुक्त होना चाहिए।

2. त्वरित निष्कर्षण किट में सुझाए गए अनुसार दोगुना करने की अनुशंसा की जाती है, जिससे वास्तव में शुद्धता और उपज में सुधार होगा।

3. अपशिष्ट द्रव को आरएनए कॉलम को नहीं छूना चाहिए।

③ आरएनए मात्रा का ठहराव

आरएनए निकाले जाने के बाद, इसे सीधे नैनोड्रॉप के साथ मात्राबद्ध किया जा सकता है, और न्यूनतम रीडिंग 10ng/ul जितनी कम हो सकती है।

④रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया

1. आरटी-क्यूपीसीआर की उच्च संवेदनशीलता के कारण, प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 3 समानांतर कुएं बनाए जाने चाहिए ताकि बाद के सीटी को बहुत अलग होने या एसडी को सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए बहुत बड़ा होने से रोका जा सके।

2. मास्टर मिश्रण को बार-बार जमाएं और पिघलाएं नहीं।

3. प्रत्येक ट्यूब/छेद को एक नई टिप से बदला जाना चाहिए!नमूने जोड़ने के लिए लगातार एक ही पिपेट टिप का उपयोग न करें!

4. नमूना डालने के बाद 96-वेल प्लेट से जुड़ी फिल्म को प्लेट से चिकना करना होगा।इसे मशीन पर डालने से पहले सेंट्रीफ्यूज करना सबसे अच्छा है, ताकि ट्यूब की दीवार पर मौजूद तरल नीचे बह सके और हवा के बुलबुले निकल जाएं।

⑤सामान्य वक्र विश्लेषण

2.5 डेटा विश्लेषण के बारे में

क्यूपीसीआर के डेटा विश्लेषण को सापेक्ष परिमाणीकरण और पूर्ण परिमाणीकरण में विभाजित किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, उपचार समूह की कोशिकाओं की तुलना नियंत्रण समूह की कोशिकाओं से की जाती है,

एक्स जीन का एमआरएनए कितनी बार बदलता है, यह सापेक्ष परिमाणीकरण है;कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या में, एक्स जीन का एमआरएनए

कितनी प्रतियाँ हैं, यह पूर्ण परिमाणीकरण है।आमतौर पर प्रयोगशाला में हम जो सबसे अधिक उपयोग करते हैं वह सापेक्ष मात्रात्मक विधि है।आम तौर पर,2-ΔΔct विधिप्रयोगों में इसका प्रयोग सबसे अधिक होता है, अत: यहां केवल इसी विधि का विस्तार से परिचय दिया जायेगा।

2-ΔΔct विधि: प्राप्त परिणाम नियंत्रण समूह में लक्ष्य जीन के सापेक्ष प्रयोगात्मक समूह में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति में अंतर है।यह आवश्यक है कि लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन दोनों की प्रवर्धन क्षमता 100% के करीब हो, और सापेक्ष विचलन 5% से अधिक न हो।

गणना विधि इस प्रकार है:

Δct नियंत्रण समूह = नियंत्रण समूह में लक्ष्य जीन का ct मान - नियंत्रण समूह में आंतरिक संदर्भ जीन का ct मान

Δct प्रायोगिक समूह = प्रायोगिक समूह में लक्ष्य जीन का ct मान - प्रायोगिक समूह में आंतरिक संदर्भ जीन का ct मान

ΔΔct=Δct प्रायोगिक समूह-Δct नियंत्रण समूह

अंत में, अभिव्यक्ति स्तर में अंतर के गुणज की गणना करें:

फोल्ड=2-ΔΔct बदलें (एक्सेल फ़ंक्शन के अनुरूप पावर है)

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