पारंपरिक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस उच्च तापमान बर्दाश्त नहीं कर सकते (एमएएमएलवी गतिविधि के लिए इष्टतम तापमान 37-50 डिग्री सेल्सियस है, और एएमवी 42-60 डिग्री सेल्सियस है)।अधिक जटिल वायरल आरएनए को कम तापमान पर प्रभावी ढंग से सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्राइब नहीं किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप पता लगाने की दक्षता में कमी आती है।पारंपरिक आरटी-क्यूपीसीआर को आम तौर पर दो प्रमुख एंजाइमों (रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और डीएनए पोलीमरेज़) की भागीदारी की आवश्यकता होती है, जिससे प्रतिक्रिया प्रणाली के संचालन को सरल बनाना और लागत को कम करना असंभव हो जाता है।यहां हम दो उच्च तापमान प्रतिरोधी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, टीटीएच और रेवटैक पेश करेंगे।इन दोनों एंजाइमों में डीएनए पोलीमरेज़ का कार्य भी होता है, इसलिए इन्हें द्विकार्यात्मक एंजाइम कहा जाता है।

टीटीएच डीएनए पोलीमरेज़

आपने TtH के बारे में सुना होगा, जो थर्मोफिलिक जीवाणु थर्मस थर्मोफिलस HB8 से प्राप्त होता है।Mg2+ जैसे द्विसंयोजक धनायनों की उपस्थिति में, इसमें डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि होती है।इसका व्यापक रूप से Taq एंजाइम की तरह पीसीआर प्रतिक्रियाओं में उपयोग किया जाता है, लेकिन इसमें Taq एंजाइम की तुलना में अधिक गर्मी प्रतिरोध होता है, इसलिए उच्च GC सामग्री टेम्पलेट्स के साथ पीसीआर पर भी इसका बेहतर प्रभाव पड़ता है।

· इस एंजाइम में मूल रूप से 3′→5′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि और 5′→3′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि नहीं है, इसलिए इसका उपयोग डाइडॉक्सी अनुक्रमण के लिए भी किया जा सकता है।

· इस एंजाइम में RTase गतिविधि होती है.Mn2+ की उपस्थिति में, RTase गतिविधि बढ़ जाएगी।इस सुविधा का उपयोग करके, इसका उपयोग रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्रतिक्रिया और पीसीआर प्रतिक्रिया को एक ही ट्यूब, यानी एक-चरण आरटी-पीसीआर में करने के लिए किया जा सकता है।हालाँकि, Mn2+ की उपस्थिति में, RT-पीसीआर की सटीकता अधिक नहीं है।आरटी गतिविधि का rnaase H गतिविधि से कोई लेना-देना नहीं है।

· टीटीएच-डीएनए पोलीमरेज़ (पीएच9, इष्टतम +55℃～+70℃, अधिकतम +95℃) की बढ़ी हुई गतिविधि आरएनए माध्यमिक संरचना के कारण होने वाली समस्याओं को दूर करती है।परिणामी सीडीएनए को Mg2+ आयनों की उपस्थिति में उसी एंजाइम के साथ पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है।

· टीटीएच-डीएनए पोलीमरेज़ की उच्च तापमान पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और डीएनए प्रवर्धन करने की क्षमता इस एंजाइम को मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, क्लोनिंग और सेलुलर और वायरल आरएनए के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाती है।
· टीटीएच-डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग आरटी-पीसीआर के लिए आरएनए को 1 केबी तक बढ़ाने के लिए किया जाता है।

विशेषताएँ एवं लाभ

टीटीएच डीएनए पोलीमरेज़:

• अनुकूलित पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पाद का आकार सुनिश्चित करें, आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया में कम से कम 1000 बीपी

• संशोधित डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट को सब्सट्रेट के रूप में स्वीकार करें

• RNase H गतिविधि से संबंधित नहीं

• आमतौर पर आरएनए में मौजूद उच्च माध्यमिक संरचना से संबंधित समस्याओं को दूर करने के लिए इसमें उच्च तापीय स्थिरता होती है

रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़

रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस गतिविधि के साथ एक गर्मी प्रतिरोधी डीएनए पोलीमरेज़

रेवटैक-आरटी-पीसीआर-डीएनए पोलीमरेज़ एक इंजीनियर, अत्यधिक गर्मी प्रतिरोधी, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधियों के साथ निर्देशित और कृत्रिम विकास के माध्यम से प्राप्त दोहरे-कार्यात्मक एंजाइम है।

· 95 डिग्री सेल्सियस पर रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ का आधा जीवन 40 मिनट से अधिक है।

· रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ आरएनए टेम्पलेट से सीधे उच्च तापमान रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की अनुमति देता है, और अधिक सीडीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण को कई बार दोहराया जा सकता है।

· रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ "शून्य-चरण" आरटी-पीसीआर (कोई इज़ोटेर्मल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण नहीं) की अनुमति देता है, क्योंकि चक्रीय पीसीआर एक्सटेंशन चरण में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और डीएनए प्रवर्धन एक साथ होता है।यह उच्च तापमान पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया को भी बढ़ावा देता है, जिससे उच्च तापमान पर आरएनए में मजबूत माध्यमिक संरचना को पिघलाने में आने वाली समस्याएं कम हो जाती हैं।

· एप्टामर-आधारित हॉट-स्टार्ट फॉर्मूला के कारण, रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ बेहतर परिणाम देगा जब एनीलिंग और एक्सटेंशन तापमान 57 डिग्री सेल्सियस से अधिक होगा।

· चूंकि एंजाइम गर्मी प्रतिरोधी है, इसलिए प्राइमर और जांच को बहुत उच्च पिघलने बिंदु (> 60 डिग्री सेल्सियस) के साथ डिजाइन करने की सिफारिश की जाती है।

· प्रतिक्रिया सेटअप प्रक्रिया के दौरान तापमान प्रवणता के माध्यम से एनीलिंग/विस्तार चरण के तापमान को अनुकूलित करने की अनुशंसा की जाती है।

· तापमान जितना अधिक होगा, पीसीआर की विशिष्टता उतनी ही अधिक होगी।रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चक्र आमतौर पर पीसीआर चक्र की तुलना में उच्च तापमान पर किया जाता है, क्योंकि डीएनए प्राइमर: आरएनए टेम्पलेट संकरण में आमतौर पर डीएनए प्राइमर: सीडीएनए टेम्पलेट डुप्लेक्स की तुलना में उच्च पिघलने बिंदु होता है।

· रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ आनुवंशिक रूप से इंजीनियर और अनुकूलित है, और एम्प्लिकॉन का आकार 60-300 बीपी के बीच है।

RevTaq RT-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ का पता लगाने की सीमा 4 प्रतियों तक पहुँच जाती है/

अनुकूलित प्रतिक्रिया प्रणाली (उच्च पिघलने बिंदु प्राइमरों की स्थापना) को चित्र में दिखाया गया है।रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़-संचालित आरटी-पीसीआर टाकपाथ 1-स्टेप आरटी-क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स की तुलना में बेहतर संवेदनशीलता दिखाता है, और कम डिटेक्शन सैंपल कमजोर पड़ने वाला ग्रेडिएंट दिखाता है।

अधिक लाभ:

त्वरित प्रारंभ फ़ंक्शन → प्रारंभिक थर्मल विकृतीकरण चरण को छोड़ा जा सकता है।

हॉट-स्टार्ट एप्टामर फॉर्मूला → तुरंत 100% एंजाइम गतिविधि प्रदान करें और कम तापमान (<57°C) पर गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को रोकें।

क्लीवेज फ़ंक्शन → आरएनए निष्कर्षण चरण को छोड़ दिया गया है, क्योंकि रेवटैक आरटी-पीसीआर डीएनए पोलीमरेज़ क्रूड प्रतिक्रिया नमूनों को भी संसाधित कर सकता है।यह गर्म आरटी-पीसीआर चक्र में यूकेरियोट्स, बैक्टीरिया और वायरस की कोशिका झिल्ली को तुरंत नष्ट कर सकता है।

आईवीडी कच्चे माल का स्तर → उच्च गुणवत्ता मानक और बेहद प्रतिस्पर्धी कीमतें