प्रारंभिक सामग्री: आरएनए
मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) एक प्रायोगिक विधि है जिसका उपयोग पीसीआर प्रयोगों में प्रारंभिक सामग्री के रूप में आरएनए का उपयोग करके किया जाता है।इस विधि में, कुल आरएनए या मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) को पहले रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा पूरक डीएनए (सीडीएनए) में स्थानांतरित किया जाता है।इसके बाद, एक टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए का उपयोग करके एक क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया की गई।आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग विभिन्न आणविक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों में किया गया है, जिसमें जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, आरएनए हस्तक्षेप सत्यापन, माइक्रोएरे सत्यापन, रोगज़नक़ का पता लगाना, आनुवंशिक परीक्षण और रोग अनुसंधान शामिल हैं।
आरटी-क्यूपीसीआर के लिए एक-चरणीय और दो-चरणीय विधियाँ
आरटी-क्यूपीसीआर को एक-चरणीय या दो-चरणीय विधि द्वारा पूरा किया जा सकता है।एक-चरण आरटी-क्यूपीसीआर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन को जोड़ता है, जिससे रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और डीएनए पोलीमरेज़ को समान बफर स्थितियों के तहत एक ही ट्यूब में प्रतिक्रिया पूरी करने की अनुमति मिलती है।एक-चरणीय आरटी-क्यूपीसीआर को केवल अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमरों के उपयोग की आवश्यकता होती है।दो-चरणीय आरटी-क्यूपीसीआर में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन दो ट्यूबों में किया जाता है, विभिन्न अनुकूलित बफ़र्स, प्रतिक्रिया स्थितियों और प्राइमर डिज़ाइन रणनीतियों का उपयोग करके।
| फ़ायदा | हानि | |
| एक कदम | इस विधि में प्रायोगिक त्रुटि कम है क्योंकि दोनों प्रतिक्रियाएँ एक ट्यूब में की जाती हैं
कम पिपेटिंग चरण संदूषण के जोखिम को कम करते हैं
उच्च-थ्रूपुट प्रवर्धन/स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त, तेज़ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य | दो-चरणीय प्रतिक्रियाओं को अलग से अनुकूलित नहीं किया जा सकता है
चूँकि दो-चरणीय प्रतिक्रिया के संयोजन से प्रतिक्रिया की स्थितियों से समझौता किया जाता है, इसलिए संवेदनशीलता दो-चरणीय विधि जितनी अच्छी नहीं होती है
एकल नमूने द्वारा पता लगाए गए लक्ष्यों की संख्या कम है |
| दो कदम | स्थिर सीडीएनए लाइब्रेरी बनाने की क्षमता जिसे लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है और कई प्रतिक्रियाओं में उपयोग किया जा सकता है
लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन को एकाधिक सीडीएनए पुस्तकालयों की आवश्यकता के बिना एक ही सीडीएनए पुस्तकालय से प्रवर्धित किया जा सकता है
प्रतिक्रिया बफ़र्स और प्रतिक्रिया स्थितियाँ जो एकल प्रतिक्रिया रन के अनुकूलन को सक्षम करती हैं
ट्रिगर स्थितियों का लचीला चयन | एकाधिक ट्यूबों का उपयोग करने और अधिक पिपेटिंग चरणों से डीएनए संदूषण का खतरा बढ़ जाता है, और समय लगता है.
एक-चरणीय विधि की तुलना में अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है |
संबंधित उत्पाद:
आरटी-क्यूपीसीआर ईज़ीᵀᴹ (एक कदम)-एसवाईबीआर ग्रीन I
आरटी-क्यूपीसीआर ईज़ीᵀᴹ (एक कदम)-ताकमान
आरटी ईज़ीᵀᴹ मैं फर्स्ट-स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस के लिए मास्टर प्रीमिक्स
रियल टाइम पीसीआर Easyᵀᴹ-SYBR ग्रीन आई किट
कुल आरएनए और एमआरएनए का चयन
आरटी-क्यूपीसीआर प्रयोग को डिजाइन करते समय, यह तय करना महत्वपूर्ण है कि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए टेम्पलेट के रूप में कुल आरएनए या शुद्ध एमआरएनए का उपयोग किया जाए या नहीं।यद्यपि एमआरएनए थोड़ी अधिक संवेदनशीलता प्रदान करने में सक्षम हो सकता है, फिर भी कुल आरएनए का उपयोग अक्सर किया जाता है।इसका कारण यह है कि प्रारंभिक सामग्री के रूप में कुल आरएनए का एमआरएनए से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है।सबसे पहले, प्रक्रिया में कम शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता होती है, जो टेम्पलेट की बेहतर मात्रात्मक पुनर्प्राप्ति और शुरुआती सेल नंबरों के परिणामों के बेहतर सामान्यीकरण को सुनिश्चित करता है।दूसरा, यह एमआरएनए संवर्धन चरण से बचता है, जो विभिन्न एमआरएनए की अलग-अलग पुनर्प्राप्ति के कारण विषम परिणामों की संभावना से बच सकता है।कुल मिलाकर, चूंकि अधिकांश अनुप्रयोगों में लक्ष्य जीन की सापेक्ष मात्रा का पता लगाने की पूर्ण संवेदनशीलता से अधिक महत्वपूर्ण है, इसलिए अधिकांश मामलों में कुल आरएनए अधिक उपयुक्त है।
रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन प्राइमर
दो-चरणीय विधि में, सीडीएनए प्रतिक्रिया को प्राइम करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग किया जा सकता है: ऑलिगो (डीटी) प्राइमर, यादृच्छिक प्राइमर, या अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर।आमतौर पर, ऑलिगो (डीटी) प्राइमर और रैंडम प्राइमर का उपयोग संयोजन में किया जाता है।ये प्राइमर टेम्पलेट एमआरएनए स्ट्रैंड से जुड़ते हैं और संश्लेषण के लिए शुरुआती बिंदु के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रदान करते हैं।
| प्राइमर चयन | संरचना और फ़ंक्शन | फ़ायदा | हानि |
| ओलिगो(डीटी) प्राइमर (या एंकर्ड ओलिगो(डीटी) प्राइमर) | एमआरएनए की पॉली(ए) पूंछ पर थाइमिन अवशेषों की विस्तारित एनीलिंग;एंकर ऑलिगो (डीटी) प्राइमर में 3′ सिरे (एंकर साइट) पर जी, सी, या ए होता है | पॉली(ए)-टेल्ड एमआरएनए से पूर्ण लंबाई सीडीएनए का संश्लेषण
यह तब लागू होता है जब शुरुआती सामग्री कम उपलब्ध हो
एंकरिंग साइट यह सुनिश्चित करती है कि ऑलिगो (डीटी) प्राइमर एमआरएनए की 5′ पॉली (ए) पूंछ से जुड़ा हुआ है | केवल पॉली(ए) टेल वाले जीन को प्रवर्धित करने के लिए उपयुक्त है
प्राइमिंग साइट*2 से पॉली(ए) में काटे गए सीडीएनए प्राप्त करें
3′ सिरे से बांधने का पक्षपाती*
*यदि एंकर्ड ऑलिगो (डीटी) प्राइमरों का उपयोग किया जाता है तो यह संभावना कम हो जाती है |
| यादृच्छिक प्राइमर
| लंबाई में 6 से 9 आधार, जो आरएनए प्रतिलेखन के दौरान कई साइटों पर जा सकते हैं | सभी आरएनए (टीआरएनए, आरआरएनए, और एमआरएनए) को एनील करें
महत्वपूर्ण माध्यमिक संरचना वाले प्रतिलेखों के लिए उपयुक्त, या जब कम प्रारंभिक सामग्री उपलब्ध हो
उच्च सीडीएनए उपज | सीडीएनए को सभी आरएनए से उल्टा ट्रांसक्राइब किया जाता है, जो आमतौर पर वांछित नहीं होता है और लक्ष्य एमआरएनए के सिग्नल को कमजोर कर सकता है।
सीडीएनए को छोटा करें |
| अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर | विशिष्ट एमआरएनए अनुक्रमों को लक्षित करने वाले कस्टम प्राइमर | विशिष्ट सीडीएनए लाइब्रेरी
संवेदनशीलता में सुधार करें
रिवर्स क्यूपीसीआर प्राइमरों का उपयोग करना | केवल एक लक्ष्य जीन के संश्लेषण तक ही सीमित है |
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक एंजाइम है जो डीएनए को संश्लेषित करने के लिए आरएनए का उपयोग करता है।कुछ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में RNase गतिविधि होती है और ट्रांसक्रिप्शन के बाद RNA-DNA हाइब्रिड स्ट्रैंड में RNA स्ट्रैंड को ख़राब कर सकते हैं।यदि इसमें RNase एंजाइमेटिक गतिविधि नहीं है, तो उच्च qपीसीआर दक्षता के लिए RNaseH को जोड़ा जा सकता है।आम तौर पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों में मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और एवियन मायलोब्लास्टोमा वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस शामिल हैं।आरटी-क्यूपीसीआर के लिए, उच्च थर्मोस्टेबिलिटी के साथ एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का चयन करना आदर्श है, ताकि सीडीएनए संश्लेषण उच्च तापमान पर किया जा सके, उच्च माध्यमिक संरचना के साथ आरएनए का सफल ट्रांसक्रिप्शन सुनिश्चित किया जा सके, जबकि प्रतिक्रिया के दौरान उनकी पूरी गतिविधि बनी रहे, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सीडीएनए पैदावार हो।
संबंधित उत्पाद:
फोरेसी एम-एमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की RNase H गतिविधि
RNaseH आरएनए-डीएनए डुप्लेक्स से आरएनए स्ट्रैंड को नीचा दिखाने में सक्षम है, जिससे डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के कुशल संश्लेषण की अनुमति मिलती है।हालाँकि, टेम्पलेट के रूप में लंबे एमआरएनए का उपयोग करते समय, आरएनए समय से पहले ख़राब हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सीडीएनए छोटा हो सकता है।इसलिए, यदि लंबे प्रतिलेखों का संश्लेषण वांछित है, तो सीडीएनए क्लोनिंग के दौरान RNaseH गतिविधि को कम करना अक्सर फायदेमंद होता है।इसके विपरीत, RNase H गतिविधि वाले रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस अक्सर qपीसीआर अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद होते हैं क्योंकि वे पीसीआर के पहले चक्र के दौरान आरएनए-डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने को बढ़ाते हैं।
प्राइमर डिज़ाइन
आरटी-क्यूपीसीआर में क्यूपीसीआर चरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर प्राइमरों को आदर्श रूप से एक एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन को फैलाने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए, जहां एक प्रवर्धन प्राइमर संभावित रूप से एक वास्तविक एक्सॉन-इंट्रॉन सीमा को फैला सकता है।चूंकि इंट्रॉन युक्त जीनोमिक डीएनए अनुक्रमों को प्रवर्धित नहीं किया जाता है, इसलिए यह डिज़ाइन जीनोमिक डीएनए को दूषित करने से प्रवर्धित झूठी सकारात्मकता के जोखिम को कम करता है।
यदि प्राइमरों को एक्सॉन या एक्सॉन-एक्सॉन सीमाओं को अलग करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया जा सकता है, तो जीनोमिक डीएनए संदूषण को हटाने के लिए आरएनए नमूनों को आरएनएज़-मुक्त डीनेज़ I या डीएसडीनेज़ के साथ इलाज करना आवश्यक हो सकता है।
आरटी-क्यूपीसीआर नियंत्रण
डीएनए संदूषण (जैसे कि जीनोमिक डीएनए या पिछली प्रतिक्रियाओं से पीसीआर उत्पाद) का पता लगाने के लिए सभी आरटी-क्यूपीसीआर प्रयोगों में एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन नकारात्मक नियंत्रण (-आरटी नियंत्रण) शामिल किया जाना चाहिए।इस नियंत्रण में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को छोड़कर सभी प्रतिक्रिया घटक शामिल हैं।चूंकि इस नियंत्रण के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन नहीं होता है, यदि पीसीआर प्रवर्धन देखा जाता है, तो डीएनए से संदूषण की संभावना सबसे अधिक है।
पोस्ट करने का समय: अगस्त-02-2022
