प्राइमर डिज़ाइन आधार (99% समस्याओं का समाधान किया जा सकता है)
1. प्राइमर लंबाई: पाठ्यपुस्तक के लिए 15-30bp की आवश्यकता होती है, आमतौर पर लगभग 20bp।विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए वास्तविक स्थिति 18-24bp होना बेहतर है, लेकिन जितना लंबा होगा उतना बेहतर होगा, बहुत लंबा प्राइमर भी विशिष्टता को कम करेगा, और उपज को कम करेगा।
2. प्राइमर प्रवर्धन अवधि: 200-500bp उपयुक्त है, और विशिष्ट परिस्थितियों में टुकड़े को 10kb तक विस्तारित किया जा सकता है।
3. प्राइमर बेस: G+C की सामग्री 40-60% होनी चाहिए, बहुत कम G+C प्रवर्धन प्रभाव अच्छा नहीं है, बहुत अधिक G+C गैर-विशिष्ट बैंड प्रदर्शित करना आसान है।एटीजीसी को 5 से अधिक प्यूरीन या पाइरीमिडीन न्यूक्लियोटाइड के समूहों से बचते हुए, यादृच्छिक रूप से सबसे अच्छा वितरित किया जाता है।स्थिरता बढ़ाने के लिए 5' अंत और मध्यवर्ती अनुक्रमों के लिए मल्टी-जीसी, 3' अंत पर समृद्ध जीसी से बचें, अंतिम 3 आधारों के लिए कोई जीसी नहीं, या अंतिम 5 आधारों में से 3 के लिए कोई जीसी नहीं।
4. प्राइमरों में द्वितीयक संरचना से बचें, और दो प्राइमरों के बीच पूरकता से बचें, विशेष रूप से 3 'अंत पर पूरकता से, अन्यथा प्राइमर डिमर बनेगा और गैर-विशिष्ट प्रवर्धित बैंड उत्पन्न होंगे।
5. प्राइमरों के तीसरे छोर पर स्थित आधारों, विशेष रूप से अंतिम और अंतिम आधारों को, अयुग्मित टर्मिनल आधारों के कारण पीसीआर विफलता से बचने के लिए सख्ती से जोड़ा जाना चाहिए।
6. प्राइमर में उचित दरार वाली साइटें होती हैं या जोड़ी जा सकती हैं, और प्रवर्धित लक्ष्य अनुक्रम में अधिमानतः उपयुक्त दरार वाली साइटें होनी चाहिए, जो दरार विश्लेषण या आणविक क्लोनिंग के लिए बहुत फायदेमंद है।
7. प्राइमरों की विशिष्टता: प्राइमरों में न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम डेटाबेस में अन्य अनुक्रमों के साथ कोई स्पष्ट समरूपता नहीं होनी चाहिए।
8. सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना सीखें: PP5, ओलिगो6, DNAstar, वेक्टर NTI, प्राइमर3 (यह ऑनलाइन डिज़ाइन सबसे अच्छा काम करता है)।
उपरोक्त सामग्री कम से कम 99% प्राइमर डिज़ाइन समस्याओं का समाधान कर सकती है।
प्राइमर डिज़ाइन के विवरण को नियंत्रित करें
1. प्राइमर की लंबाई
सामान्य प्राइमर की लंबाई 18~30 बेस है।सामान्य तौर पर, प्राइमर के एनीलिंग तापमान को निर्धारित करने वाला सबसे महत्वपूर्ण कारक प्राइमर की लंबाई है।प्राइमर का एनीलिंग तापमान आम तौर पर चुना जाता है (टीएम मान -5℃), और कुछ सीधे टीएम मान का उपयोग करते हैं।प्राइमरों के एनीलिंग तापमान की मोटे तौर पर गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग किया जा सकता है।
जब प्राइमर की लंबाई 20बीपी से कम हो: [4(जी+सी)+2(ए+टी)]-5℃
जब प्राइमर की लंबाई 20bp से अधिक हो: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/लंबाई-5℃
इसके अलावा, कई सॉफ्टवेयर का उपयोग एनीलिंग तापमान की गणना के लिए भी किया जा सकता है, गणना सिद्धांत अलग होगा, इसलिए कभी-कभी गणना मूल्य में एक छोटा सा अंतर हो सकता है।पीसीआर प्रतिक्रियाओं को अनुकूलित करने के लिए, सर्वोत्तम दक्षता और विशिष्टता के लिए सबसे छोटे प्राइमरों का उपयोग किया जाता है जो 54℃ से कम का एनीलिंग तापमान सुनिश्चित नहीं करते हैं।
कुल मिलाकर, प्रत्येक अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड के लिए प्राइमर विशिष्टता चार गुना बढ़ जाती है, ताकि अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए न्यूनतम प्राइमर लंबाई 18 न्यूक्लियोटाइड हो।प्राइमर की लंबाई की ऊपरी सीमा बहुत महत्वपूर्ण नहीं है, मुख्य रूप से प्रतिक्रिया दक्षता से संबंधित है।एन्ट्रॉपी के कारण, प्राइमर जितना लंबा होगा, डीएनए पोलीमरेज़ को बांधने के लिए एक स्थिर डबल-स्ट्रैंडेड टेम्पलेट बनाने के लिए लक्ष्य डीएनए से जुड़ने की दर उतनी ही कम होगी।
प्राइमरों को डिज़ाइन करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते समय, प्राइमरों की लंबाई बदले में टीएम मान द्वारा निर्धारित की जा सकती है, विशेष रूप से प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर के प्राइमरों के लिए, टीएम = 60 ℃ या तो नियंत्रित किया जाना चाहिए।
2.जीसी सामग्री
आम तौर पर, प्राइमर अनुक्रमों में जी+सी की सामग्री 40% ~ 60% होती है, और प्राइमर की एक जोड़ी की जीसी सामग्री और टीएम मान को समन्वित किया जाना चाहिए।यदि प्राइमर में गंभीर जीसी या एटी प्रवृत्ति है, तो प्राइमर के 5' सिरे पर उचित मात्रा में ए, टी या जी और सी टेल मिलाया जा सकता है।
3. एनीलिंग तापमान
एनीलिंग तापमान अनचेन तापमान से 5℃ कम होना चाहिए।यदि प्राइमर बेस की संख्या कम है, तो एनीलिंग तापमान को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है, जिससे पीसीआर की विशिष्टता बढ़ सकती है।यदि आधारों की संख्या बड़ी है, तो एनीलिंग तापमान को उचित रूप से कम किया जा सकता है।4℃ ~ 6℃ के प्राइमरों की एक जोड़ी के बीच एनीलिंग तापमान का अंतर पीसीआर उपज को प्रभावित नहीं करेगा, लेकिन आदर्श रूप से प्राइमरों की एक जोड़ी का एनीलिंग तापमान समान है, जो 55℃ ~ 75℃ के बीच भिन्न हो सकता है।
4. प्रवर्धन टेम्पलेट के द्वितीयक संरचना क्षेत्र से बचें
प्रवर्धित टुकड़े का चयन करते समय टेम्पलेट के द्वितीयक संरचना क्षेत्र से बचना सबसे अच्छा है।लक्ष्य खंड की स्थिर माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी और अनुमान प्रासंगिक कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर द्वारा लगाया जा सकता है, जो टेम्पलेट चयन के लिए सहायक है।प्रायोगिक परिणाम बताते हैं कि विस्तार अक्सर असफल होता है जब विस्तार किए जाने वाले क्षेत्र की मुक्त ऊर्जा (△G) 58.6lkJ/mol से कम होती है।
5. लक्ष्य डीएनए के साथ बेमेल
जब प्रवर्धित लक्ष्य डीएनए अनुक्रम बड़ा होता है, तो एक प्राइमर लक्ष्य डीएनए के कई हिस्सों से जुड़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप परिणाम में कई बैंड दिखाई देते हैं।इस बार BLAST सॉफ़्टवेयर परीक्षण का उपयोग करना आवश्यक है, वेबसाइट:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.दो अनुक्रमों को संरेखित करें (bl2seq) चुनें।
ज़ोन 1 में प्राइमर अनुक्रम और ज़ोन 2 में लक्षित डीएनए अनुक्रम चिपकाना विनिमेय है, और BLAST पूरक, एंटीसेंस और अन्य संभावनाओं की गणना करता है, इसलिए उपयोगकर्ताओं को यह नोटिस करने की आवश्यकता नहीं है कि दोनों श्रृंखलाएं सेंस चेन हैं या नहीं।यदि आप डेटाबेस में अनुक्रम की जीआई संख्या जानते हैं तो आप जीआई संख्या भी दर्ज कर सकते हैं, इसलिए आपको अनुक्रम का एक बड़ा भाग चिपकाने की आवश्यकता नहीं है।अंत में, यह देखने के लिए 3 पर संरेखित करें पर क्लिक करें कि क्या प्राइमर के लक्ष्य डीएनए में एकाधिक समजात साइटें हैं।
6. प्राइमर टर्मिनल
प्राइमर का 3' अंत वह जगह है जहां एक्सटेंशन शुरू होता है, इसलिए बेमेल को वहां से शुरू होने से रोकना महत्वपूर्ण है।3 'छोर लगातार 3 G या C से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि इससे G+C संवर्धन अनुक्रम क्षेत्र में प्राइमर गलती से चालू हो जाएगा।विशेष पीसीआर (एएस-पीसीआर) प्रतिक्रियाओं को छोड़कर, 3 'छोर किसी भी माध्यमिक संरचना का निर्माण नहीं कर सकता है, प्राइमर के 3' सिरे को बेमेल नहीं किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, यदि एन्कोडिंग क्षेत्र को प्रवर्धित किया जाता है, तो प्राइमर के 3 'अंत को कोडन की तीसरी स्थिति पर समाप्त नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि कोडन की तीसरी स्थिति में गिरावट का खतरा होता है, जो प्रवर्धन की विशिष्टता और दक्षता को प्रभावित करेगा।एनेक्सेशन प्राइमर का उपयोग करते समय, कोडन उपयोग तालिका देखें, जैविक प्राथमिकता पर ध्यान दें, 3′ छोर पर एनेक्सेशन प्राइमर का उपयोग न करें, और प्राइमर की उच्च सांद्रता (1uM-3uM) का उपयोग करें।
7. प्राइमरों की माध्यमिक संरचना
प्राइमरों में स्वयं पूरक अनुक्रम नहीं होने चाहिए, अन्यथा प्राइमर स्वयं हेयरपिन संरचनाओं में बदल जाएंगे, और यह द्वितीयक संरचना स्थैतिक बाधा के कारण प्राइमरों और टेम्पलेट्स के बंधन को प्रभावित करेगी।यदि कृत्रिम निर्णय का उपयोग किया जाता है, तो प्राइमरों का निरंतर पूरक आधार स्वयं 3bp से अधिक नहीं होना चाहिए।दो प्राइमरों के बीच कोई पूरकता नहीं होनी चाहिए, विशेष रूप से प्राइमर डिमर्स के गठन को रोकने के लिए 3 'अंत के पूरक ओवरलैप से बचा जाना चाहिए।सामान्य तौर पर, प्राइमरों की एक जोड़ी के बीच लगातार 4 से अधिक आधार समरूपता या संपूरकता नहीं होनी चाहिए।
8. मार्कर या लोकी जोड़ें
5'अंत का प्रवर्धन विशिष्टता पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है और इसलिए इसे प्रवर्धन विशिष्टता को प्रभावित किए बिना संशोधित किया जा सकता है।प्राइमर 5' के अंत में संशोधन में शामिल हैं: एंजाइम प्रतिबंध साइट जोड़ना;बायोटिन, प्रतिदीप्ति, डिगॉक्सिन, ईयू3+ आदि लेबल। प्रोटीन बाइंडिंग डीएनए अनुक्रम का परिचय दें;उत्परिवर्तन साइटों का परिचय, उत्परिवर्तन अनुक्रमों को सम्मिलित करना और गायब करना और प्रवर्तक अनुक्रमों को प्रस्तुत करना आदि। अतिरिक्त आधार कमोबेश प्रवर्धन की दक्षता को प्रभावित करेंगे और प्राइमर डिमर गठन की संभावना को बढ़ाएंगे, लेकिन अगले चरण के लिए कुछ रियायतें दी जानी चाहिए।अतिरिक्त अनुक्रम जो लक्ष्य अनुक्रम पर मौजूद नहीं हैं, जैसे प्रतिबंध साइटें और प्रमोटर अनुक्रम, विशिष्टता को प्रभावित किए बिना प्राइमर के 5' अंत में जोड़े जा सकते हैं।इन अनुक्रमों को प्राइमर टीएम मानों की गणना में शामिल नहीं किया गया है, लेकिन पूरकता और आंतरिक माध्यमिक संरचना के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।
9. उपक्लोन
अधिकांश समय, पीसीआर केवल प्रारंभिक क्लोनिंग होती है, और फिर हमें लक्ष्य टुकड़े को विभिन्न वैक्टरों में उप-क्लोन करने की आवश्यकता होती है, इसलिए हमें पीसीआर चरण में अगले ऑपरेशन के लिए अतिरिक्त आधार डिजाइन करने की आवश्यकता होती है।
सबक्लोनिंग के लिए डिज़ाइन किए गए कुछ अनुक्रमों का सारांश नीचे दिया गया है।
प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ प्रतिबंध स्थल जोड़ा गया
पीसीआर उत्पादों की सबक्लोनिंग के लिए एंजाइम प्रतिबंध साइटों को जोड़ना सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है।आम तौर पर, दरार वाली जगह छह आधारों वाली होती है, दरार वाली जगह के 5' सिरे के अलावा 2 ~ 3 सुरक्षात्मक आधार जोड़ने की जरूरत होती है।हालाँकि, विभिन्न एंजाइमों के लिए आवश्यक सुरक्षात्मक आधारों की संख्या अलग-अलग होती है।उदाहरण के लिए, SalⅠ को किसी सुरक्षात्मक आधार की आवश्यकता नहीं है, EcoRⅤ को 1 सुरक्षात्मक आधार की आवश्यकता है, NotⅠ को 2 सुरक्षात्मक आधारों की आवश्यकता नहीं है, और हिंद Ⅲ को 3 सुरक्षात्मक आधारों की आवश्यकता है।
एलआईसी पूंछ जोड़ता है
एलआईसी का पूरा नाम लिगेशन-इंडिपेंडेंट क्लोनिंग है, जो कि नेवोजेन द्वारा विशेष रूप से पीईटी वेक्टर के अपने हिस्से के लिए आविष्कार की गई एक क्लोनिंग विधि है।एलआईसी विधि द्वारा तैयार किए गए पीईटी कैरियर में गैर-पूरक 12-15 बेस सिंगल स्ट्रैंड स्टिकी सिरे होते हैं, जो लक्ष्य सम्मिलित टुकड़े पर संबंधित चिपचिपे सिरे को पूरक करते हैं।प्रवर्धन उद्देश्यों के लिए, सम्मिलित टुकड़े का प्राइमर 5′ अनुक्रम एलआईसी वेक्टर का पूरक होना चाहिए।टी4 डीएनए पोलीमरेज़ की 3′→5′ एक्सट्रेक्ट गतिविधि थोड़े समय के बाद डाले गए टुकड़े पर एक एकल स्ट्रैंड चिपचिपा अंत बना सकती है।क्योंकि उत्पाद केवल तैयार किए गए इंसर्ट टुकड़े और वेक्टर के पारस्परिक एनीलिंग से ही बनाया जा सकता है, यह विधि बहुत तेज़ और कुशल है, और यह क्लोनिंग निर्देशित है।
निर्देशित टीए क्लोन पूंछ जोड़ें
टीए क्लोनिंग एक वेक्टर में टुकड़े को लक्षित करने में असमर्थ थी, इसलिए बाद में इनविट्रोजन ने एक वेक्टर पेश किया जो क्लोनिंग को लक्षित कर सकता था, जिसमें एक छोर पर चार प्रमुख आधार जीटीजीजीएस शामिल थे।इसलिए, पीसीआर प्राइमरों के डिज़ाइन में, तदनुसार पूरक अनुक्रम जोड़े जाने चाहिए, ताकि टुकड़ों को "उन्मुख" किया जा सके।
यदि आपके पास समय की कमी है, तो आप जीन को वेक्टर के साथ मिलाकर सीधे संश्लेषण का प्रयास कर सकते हैं, जिसे हम मस्कुलरिस्ट में ईटी जीन संश्लेषण कहते हैं।
डी. इन-फ्यूजन क्लोनिंग विधि
किसी लिगेज की आवश्यकता नहीं, किसी लंबी प्रतिक्रिया की आवश्यकता नहीं।जब तक रेखीयकृत वेक्टर के दोनों सिरों पर एक अनुक्रम प्राइमर के डिजाइन में पेश किया जाता है, तब तक पीसीआर उत्पाद और रेखीयकृत वेक्टर को बीएसए युक्त इन-फ्यूजन एंजाइम समाधान में जोड़ा जाता है और आधे घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखा जाता है, परिवर्तन किया जा सकता है।यह विधि बड़ी मात्रा में रूपांतरण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।
10. मर्ज प्राइमर
कभी-कभी, प्राइमर डिज़ाइन के बारे में केवल सीमित अनुक्रम जानकारी ही ज्ञात होती है।उदाहरण के लिए, यदि केवल अमीनो एसिड अनुक्रम ज्ञात है, तो मर्जिंग प्राइमर को डिज़ाइन किया जा सकता है।एक मर्जर प्राइमर विभिन्न अनुक्रमों का मिश्रण है जो सभी अलग-अलग आधार संभावनाओं का प्रतिनिधित्व करता है जो एक एकल अमीनो एसिड को एन्कोड करता है।विशिष्टता बढ़ाने के लिए, आप विभिन्न जीवों की आधार उपयोग प्राथमिकताओं के अनुसार संयोजन को कम करने के लिए कोडन उपयोग तालिका का उल्लेख कर सकते हैं।प्राइमर के एनीलिंग तापमान को कम करने के लिए हाइपोक्सैन्थिन को सभी आधारों के साथ जोड़ा जा सकता है।प्राइमर के 3′ सिरे पर संलग्न आधारों का उपयोग न करें क्योंकि 3′ सिरे पर अंतिम 3 आधारों की एनीलिंग गलत साइट पर पीसीआर आरंभ करने के लिए पर्याप्त है।उच्च प्राइमर सांद्रता (1μM से 3μM) का उपयोग किया जाता है क्योंकि कई एनेक्सेशन मिश्रणों में प्राइमर लक्ष्य टेम्पलेट के लिए विशिष्ट नहीं होते हैं।
पीसीआर कच्चे मालनियंत्रण
1. प्राइमर मात्रा
प्रत्येक प्राइमर की सांद्रता 0.1 ~ 1umol या 10 ~ 100pmol है।प्राइमर की न्यूनतम मात्रा के साथ आवश्यक परिणाम प्राप्त करना बेहतर है।प्राइमर की उच्च सांद्रता बेमेल और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कारण बनेगी, और प्राइमरों के बीच डिमर बनने की संभावना बढ़ जाएगी।
2. प्राइमर एकाग्रता
प्राइमरों की सांद्रता विशिष्टता को प्रभावित करती है।इष्टतम प्राइमर सांद्रता आम तौर पर 0.1 और 0.5μM के बीच होती है।उच्च प्राइमर सांद्रता से गैर-विशिष्ट उत्पादों का प्रवर्धन होता है।
3. प्राइमर का एनीलिंग तापमान
प्राइमर के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर पिघलने का तापमान (टीएम) है।यह वह तापमान है जब 50% प्राइमर और पूरक अनुक्रमों को डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए अणुओं के रूप में दर्शाया जाता है।पीसीआर एनीलिंग तापमान सेट करने के लिए टीएम की आवश्यकता होती है।आदर्श रूप से, लक्ष्य अनुक्रम के साथ प्राइमरों की प्रभावी एनीलिंग सुनिश्चित करने के लिए एनीलिंग तापमान काफी कम है, लेकिन गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए पर्याप्त उच्च है।55℃ से 70℃ तक उचित एनीलिंग तापमान।एनीलिंग तापमान आमतौर पर प्राइमर के टीएम से 5℃ कम सेट किया जाता है।
टीएम को सेट करने के लिए कई सूत्र हैं, जो उपयोग किए गए सूत्र और प्राइमरों के अनुक्रम के आधार पर काफी भिन्न होते हैं।क्योंकि अधिकांश सूत्र अनुमानित टीएम मान प्रदान करते हैं, सभी एनीलिंग तापमान केवल एक प्रारंभिक बिंदु हैं।एनीलिंग तापमान को उत्तरोत्तर बढ़ाने वाली कई प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करके विशिष्टता में सुधार किया जा सकता है।अनुमानित Tm-5℃ से नीचे शुरू करें, और धीरे-धीरे 2℃ की वृद्धि में एनीलिंग तापमान बढ़ाएं।उच्च एनीलिंग तापमान से प्राइमर डिमर्स और गैर-विशिष्ट उत्पादों का निर्माण कम हो जाएगा।सर्वोत्तम परिणामों के लिए, दोनों प्राइमरों में अनुमानित Tm मान होना चाहिए।यदि प्राइमर जोड़े का टीएम अंतर 5 ℃ से अधिक है, तो प्राइमर चक्र में कम एनीलिंग तापमान का उपयोग करके एक महत्वपूर्ण झूठी शुरुआत दिखाएगा।यदि दो प्राइमर टीएम अलग-अलग हैं, तो एनीलिंग तापमान को न्यूनतम टीएम से 5℃ कम पर सेट करें।वैकल्पिक रूप से, विशिष्टता बढ़ाने के लिए, पांच चक्र पहले उच्च टीएम के लिए डिज़ाइन किए गए एनीलिंग तापमान पर किए जा सकते हैं, इसके बाद शेष चक्र कम टीएम के लिए डिज़ाइन किए गए एनीलिंग तापमान पर किए जा सकते हैं।यह कठिन परिस्थितियों में गंतव्य टेम्पलेट की आंशिक प्रतिलिपि प्राप्त करने की अनुमति देता है।
4. प्राइमर की शुद्धता और स्थिरता
अधिकांश पीसीआर अनुप्रयोगों के लिए कस्टम प्राइमरों की मानक शुद्धता पर्याप्त है।डीसेल्टिंग द्वारा बेंज़ोयल और आइसोब्यूटाइल समूहों को हटाना न्यूनतम है और इसलिए पीसीआर में हस्तक्षेप नहीं करता है।कुछ अनुप्रयोगों को संश्लेषण प्रक्रिया में किसी भी गैर-पूर्ण-लंबाई अनुक्रम को हटाने के लिए शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है।ये संक्षिप्त अनुक्रम इसलिए होते हैं क्योंकि डीएनए संश्लेषण रसायन विज्ञान की दक्षता 100% नहीं है।यह एक गोलाकार प्रक्रिया है जिसमें बार-बार होने वाली रासायनिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग किया जाता है क्योंकि डीएनए को 3′ से 5′ तक बनाने के लिए प्रत्येक आधार को जोड़ा जाता है।आप किसी भी चक्र में असफल हो सकते हैं।लंबे प्राइमरों, विशेष रूप से 50 से अधिक आधारों वाले, में बड़े पैमाने पर कटे हुए अनुक्रम होते हैं और उन्हें शुद्धिकरण की आवश्यकता हो सकती है।
प्राइमरों की उपज सिंथेटिक रसायन विज्ञान और शुद्धिकरण विधि की दक्षता से प्रभावित होती है।साइटोलॉजी और शेंगोंग जैसी बायोफार्मास्युटिकल कंपनियां ऑलिगोन्यूक्लियोसाइड के कुल उत्पादन को सुनिश्चित करने के लिए न्यूनतम ओडी इकाई का उपयोग करती हैं।कस्टम प्राइमर सूखे पाउडर के रूप में भेजे जाते हैं।टीई में प्राइमरों को फिर से घोलना सबसे अच्छा है ताकि अंतिम एकाग्रता 100μM हो।टीई विआयनीकृत पानी से बेहतर है क्योंकि पानी का पीएच अक्सर अम्लीय होता है और ऑलिगोन्यूक्लियोसाइड्स के हाइड्रोलिसिस का कारण बनेगा।
प्राइमरों की स्थिरता भंडारण की स्थिति पर निर्भर करती है।सूखे पाउडर और घुले हुए प्राइमर को -20℃ पर संग्रहित किया जाना चाहिए।10μM से अधिक सांद्रता पर TE में घुले प्राइमर को 6 महीने के लिए -20℃ पर स्थिर रूप से संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन केवल कमरे के तापमान (15℃ से 30℃) पर 1 सप्ताह से कम समय के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।सूखे पाउडर प्राइमर को -20 C पर कम से कम 1 साल तक और कमरे के तापमान (15 C से 30 C) पर 2 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
5. एंजाइम और उनकी सांद्रता
वर्तमान में, इस्तेमाल किया जाने वाला टाक डीएनए पोलीमरेज़ मूल रूप से कोलीफॉर्म बैक्टीरिया द्वारा संश्लेषित जीन इंजीनियरिंग एंजाइम है।एक सामान्य पीसीआर प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा लगभग 2.5U है (100ul की कुल प्रतिक्रिया मात्रा को संदर्भित करता है)।यदि सांद्रता बहुत अधिक है, तो इससे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हो सकता है;यदि सांद्रता बहुत कम है, तो सिंथेटिक उत्पाद की मात्रा कम हो जाएगी।
6. डीएनटीपी की गुणवत्ता और एकाग्रता
डीएनटीपी की गुणवत्ता एकाग्रता और पीसीआर प्रवर्धन की दक्षता से निकटता से संबंधित है।डीएनटीपी पाउडर दानेदार होता है, और यदि इसे अनुचित तरीके से संग्रहीत किया जाता है, तो इसकी परिवर्तनशीलता इसकी जैविक गतिविधि खो देती है।dNTP समाधान अम्लीय है, और इसका PH को 7.0 ~ 7.5 पर समायोजित करने के लिए 1M NaOH या 1M ट्रिस.HCL बफर समाधान के साथ उच्च सांद्रता में उपयोग किया जाना चाहिए, उप-पैकेजिंग की छोटी मात्रा, -20 ℃ पर जमे हुए भंडारण।एकाधिक फ़्रीज़-पिघलना dNTP को ख़राब कर देगा।पीसीआर प्रतिक्रिया में, dNTP 50 ~ 200umol/L होना चाहिए।विशेष रूप से इस बात पर ध्यान देना चाहिए कि चारों डीएनटीपीएस की सांद्रता बराबर (बराबर मोल तैयारी) होनी चाहिए।यदि उनमें से किसी एक की सांद्रता दूसरों से भिन्न (उच्च या निम्न) है, तो बेमेल हो जाएगा।बहुत कम सांद्रता पीसीआर उत्पादों की उपज को कम कर देगी।dNTP Mg2+ के साथ संयोजन कर सकता है और मुक्त Mg2+ की सांद्रता को कम कर सकता है।
7. टेम्पलेट (लक्ष्य जीन) न्यूक्लिक एसिड
टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिड की मात्रा और शुद्धिकरण डिग्री पीसीआर की सफलता या विफलता के लिए महत्वपूर्ण लिंक में से एक है।पारंपरिक डीएनए शुद्धिकरण विधियां आमतौर पर नमूनों को पचाने और निपटाने के लिए एसडीएस और प्रोटीज़ K का उपयोग करती हैं।एसडीएस के मुख्य कार्य हैं: कोशिका झिल्ली पर लिपिड और प्रोटीन को घोलना, इस प्रकार झिल्ली प्रोटीन को घोलकर कोशिका झिल्ली को नष्ट करना, और कोशिका में परमाणु प्रोटीन को अलग करना, एसडीएस प्रोटीन के साथ संयोजन भी कर सकता है और अवक्षेपित कर सकता है;प्रोटीज़ K प्रोटीन को हाइड्रोलाइज़ और पचा सकता है, विशेष रूप से डीएनए से बंधे हिस्टोन को, और फिर प्रोटीन और अन्य कोशिका घटकों को निकालने के लिए कार्बनिक विलायक फिनोल और क्लोरोफॉर्म का उपयोग करता है, और न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करने के लिए इथेनॉल या आइसोप्रोपिल अल्कोहल का उपयोग करता है।निकाले गए न्यूक्लिक एसिड का उपयोग पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जा सकता है।सामान्य नैदानिक पता लगाने वाले नमूनों के लिए, एक त्वरित और सरल विधि का उपयोग कोशिकाओं को भंग करने, रोगजनकों को लाइसेट करने, क्रोमोसोम से मुक्त लक्ष्य जीन तक प्रोटीन को पचाने और हटाने के लिए किया जा सकता है, और सीधे पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयोग किया जा सकता है।आरएनए टेम्प्लेट निष्कर्षण आमतौर पर आरएनएज़ को आरएनए को ख़राब होने से रोकने के लिए गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट या प्रोटीज़ के विधि का उपयोग करता है।
8.Mg2+ सांद्रता
Mg2+ का पीसीआर प्रवर्धन की विशिष्टता और उपज पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।सामान्य पीसीआर प्रतिक्रिया में, जब विभिन्न dNTP की सांद्रता 200umol/L होती है, तो Mg2+ की उचित सांद्रता 1.5 ~ 2.0mmol/L होती है।Mg2+ सांद्रता बहुत अधिक है, प्रतिक्रिया विशिष्टता कम हो जाती है, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होता है, बहुत कम सांद्रता Taq DNA पोलीमरेज़ की गतिविधि को कम कर देगी, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया उत्पादों में कमी आएगी।
मैग्नीशियम आयन पीसीआर के कई पहलुओं को प्रभावित करते हैं, जैसे डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि, जो उपज को प्रभावित करती है;एक अन्य उदाहरण प्राइमर एनीलिंग है, जो विशिष्टता को प्रभावित करता है।डीएनटीपी और टेम्पलेट मैग्नीशियम आयन से जुड़ते हैं, जिससे एंजाइम गतिविधि के लिए आवश्यक मुक्त मैग्नीशियम आयन की मात्रा कम हो जाती है।विभिन्न प्राइमर जोड़े और टेम्पलेट्स के लिए इष्टतम मैग्नीशियम आयन एकाग्रता भिन्न होती है, लेकिन 200μM dNTP के साथ एक विशिष्ट पीसीआर प्रारंभिक एकाग्रता 1.5 मिमी है (नोट: वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर के लिए, एक फ्लोरोसेंट जांच के साथ 3 से 5 मिमी मैग्नीशियम आयन समाधान का उपयोग करें)।मुक्त मैग्नीशियम आयनों की उच्च सांद्रता उपज में वृद्धि करती है, लेकिन गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को भी बढ़ाती है और निष्ठा को कम करती है।इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए, मैग्नीशियम आयन अनुमापन 1mM से 3mM तक 0.5mM की वृद्धि में किया गया था।मैग्नीशियम आयन अनुकूलन पर निर्भरता को कम करने के लिए, प्लैटिनम टाक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग किया जा सकता है।प्लैटिनम टाक डीएनए पोलीमरेज़, टाक डीएनए पोलीमरेज़ की तुलना में मैग्नीशियम आयन सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर कार्य बनाए रखने में सक्षम है और इसलिए कम अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
9. पीसीआर-प्रचारक योजक
एनीलिंग तापमान, प्राइमर डिज़ाइन और मैग्नीशियम आयन सांद्रता का अनुकूलन अधिकांश टेम्पलेट्स के अत्यधिक विशिष्ट प्रवर्धन के लिए पर्याप्त है;हालाँकि, कुछ टेम्प्लेट, जिनमें उच्च GC सामग्री वाले टेम्प्लेट भी शामिल हैं, को अतिरिक्त उपायों की आवश्यकता होती है।डीएनए के पिघलने के तापमान को प्रभावित करने वाले योजक उत्पाद विशिष्टता और उपज में सुधार करने का एक और तरीका प्रदान करते हैं।सर्वोत्तम परिणामों के लिए टेम्पलेट का पूर्ण विकृतीकरण आवश्यक है।
इसके अलावा, द्वितीयक संरचना प्राइमर बंधन और एंजाइम विस्तार को रोकती है।
फॉर्मामाइड, डीएमएसओ, ग्लिसरीन, बीटाइन और पीसीआरएक्स एन्हांसर सॉल्यूशन सहित पीसीआर एडिटिव्स प्रवर्धन को बढ़ाते हैं।उनका संभावित तंत्र पिघलने के तापमान को कम करना है, इस प्रकार प्राइमरों की एनीलिंग में सहायता करना और माध्यमिक संरचना क्षेत्र के माध्यम से डीएनए पोलीमरेज़ विस्तार में सहायता करना है।पीसीआरएक्स सॉल्यूशन के अन्य फायदे हैं।प्लैटिनम टाक डीएनए पोलीमरेज़ और प्लैटिनम पीएफएक्स डीएनए पोलीमरेज़ के साथ उपयोग करने पर न्यूनतम मैग्नीशियम आयन अनुकूलन की आवश्यकता होती है।इस प्रकार, तीसरे दृष्टिकोण, मैग्नीशियम आयन अनुकूलन की निर्भरता को कम करते हुए विशिष्टता बढ़ाने के लिए प्लेटिनम तकनीक को एडिटिव के साथ जोड़ा जाता है।सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एडिटिव्स की सांद्रता को अनुकूलित किया जाना चाहिए, विशेष रूप से डीएमएसओ, फॉर्मामाइड और ग्लिसरॉल, जो टैक डीएनए पोलीमरेज़ को रोकते हैं।
10. गरम शुरुआत
अच्छे प्राइमर डिज़ाइन के अलावा पीसीआर विशिष्टता में सुधार करने के लिए हॉट स्टार्ट पीसीआर सबसे महत्वपूर्ण तरीकों में से एक है।यद्यपि टाक डीएनए पोलीमरेज़ का इष्टतम बढ़ाव तापमान 72℃ है, पोलीमरेज़ कमरे के तापमान पर सक्रिय रहता है।इस प्रकार, गैर-विशिष्ट उत्पाद तब उत्पन्न होते हैं जब पीसीआर प्रतिक्रिया की तैयारी के दौरान और थर्मल चक्र की शुरुआत में होल्डिंग तापमान एनीलिंग तापमान से कम होता है।एक बार बनने के बाद, इन गैर-विशिष्ट उत्पादों को प्रभावी ढंग से बढ़ाया जाता है।हॉट-स्टार्ट पीसीआर विशेष रूप से तब प्रभावी होता है जब प्राइमर डिज़ाइन के लिए उपयोग की जाने वाली साइटें आनुवंशिक तत्वों के स्थान से सीमित होती हैं, जैसे कि साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन, अभिव्यक्ति क्लोनिंग, या डीएनए इंजीनियरिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले आनुवंशिक तत्वों का निर्माण और हेरफेर।
टैक डीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि को सीमित करने की एक सामान्य विधि बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान तैयार करना और इसे पहले से गरम पीसीआर उपकरण में रखना है।यह विधि सरल और सस्ती है, लेकिन यह एंजाइम की गतिविधि को पूरा नहीं करती है और इसलिए गैर-विशिष्ट उत्पादों के प्रवर्धन को पूरी तरह से समाप्त नहीं करती है।
थर्मल प्राइमिंग एक आवश्यक घटक को रोककर डीएनए संश्लेषण में देरी करता है जब तक कि पीसीआर उपकरण विकृतीकरण तापमान तक नहीं पहुंच जाता।टाक डीएनए पोलीमरेज़ के विलंबित जोड़ सहित अधिकांश मैनुअल थर्मल दीक्षा विधियां बोझिल हैं, खासकर उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए।अन्य थर्मल प्राइमिंग विधियां मैग्नीशियम आयनों या एंजाइमों सहित एक आवश्यक घटक को घेरने के लिए, या टेम्पलेट्स और बफर जैसे प्रतिक्रियाशील घटकों को भौतिक रूप से अलग करने के लिए मोम ढाल का उपयोग करती हैं।थर्मल चक्र के दौरान, मोम के पिघलने पर विभिन्न घटक निकल जाते हैं और एक साथ मिल जाते हैं।मैनुअल हॉट स्टार्ट विधि की तरह, वैक्स शील्ड विधि बोझिल है और संदूषण का खतरा है और उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है।
प्लेटिनम डीएनए पोलीमरेज़ स्वचालित हॉट स्टार्ट पीसीआर के लिए सुविधाजनक और कुशल है।प्लैटिनम टाक डीएनए पोलीमरेज़ में पुनः संयोजक टाक डीएनए पोलीमरेज़ होता है जो टाक डीएनए पोलीमरेज़ के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ संयुक्त होता है।लंबे समय तक तापमान बनाए रखने के दौरान एंजाइम गतिविधि को रोकने के लिए पीसीआर द्वारा एंटीबॉडी तैयार की जाती हैं।टैक डीएनए पोलीमरेज़ को विकृतीकरण चरण के 94℃ इन्सुलेशन के दौरान प्रतिक्रिया में छोड़ा गया, जिससे पूर्ण पोलीमरेज़ गतिविधि बहाल हो गई।थर्मल दीक्षा के लिए रासायनिक रूप से संशोधित टैक डीएनए पोलीमरेज़ के विपरीत, प्लैटिनम एंजाइम को पोलीमरेज़ को सक्रिय करने के लिए 94℃ (10 से 15 मिनट) पर लंबे समय तक इन्सुलेशन की आवश्यकता नहीं होती है।प्लैटिनमटैक डीएनए पोलीमरेज़ के साथ, 94 ℃ पर 2 मिनट के बाद 90% टैक डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि बहाल हो गई।
फोरेसी एचएस टैक डीएनए पोलीमरेज़
11. नेस्ट-पीसीआर
नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धन के क्रमिक दौर विशिष्टता और संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं।पहला दौर 15 से 20 चक्रों का मानक प्रवर्धन है।प्रारंभिक प्रवर्धन उत्पाद का एक छोटा सा अंश 100 से 1000 बार पतला किया गया और 15 से 20 चक्रों के लिए प्रवर्धन के दूसरे दौर में जोड़ा गया।वैकल्पिक रूप से, प्रारंभिक प्रवर्धित उत्पाद को जेल शुद्धि द्वारा आकार दिया जा सकता है।प्रवर्धन के दूसरे दौर में एक नेस्टेड प्राइमर का उपयोग किया जाता है, जो पहले प्राइमर के अंदर लक्ष्य अनुक्रम से जुड़ सकता है।नेस्टेड पीसीआर के उपयोग से कई लक्ष्य साइटों के प्रवर्धन की संभावना कम हो जाती है क्योंकि प्राइमर के दोनों सेटों के पूरक कुछ लक्ष्य अनुक्रम होते हैं।समान प्राइमरों के साथ चक्रों की समान कुल संख्या (30 से 40) ने गैर-विशिष्ट साइटों को बढ़ाया।नेस्टेड पीसीआर सीमित लक्ष्य अनुक्रमों (उदाहरण के लिए, दुर्लभ एमआरएनए) की संवेदनशीलता को बढ़ाता है और कठिन पीसीआरएस (उदाहरण के लिए 5′ RACE) की विशिष्टता में सुधार करता है।
12. अवरोही पीसीआर
अवरोही पीसीआर पीसीआर के पहले कुछ चक्रों के लिए सख्त एनीलिंग स्थितियों का उपयोग करके विशिष्टता में सुधार करता है।चक्र अनुमानित टीएम से लगभग 5℃ अधिक एनीलिंग तापमान पर शुरू होता है, फिर प्रत्येक चक्र को 1℃ से 2℃ तक कम किया जाता है जब तक कि एनीलिंग तापमान टीएम 5℃ से नीचे न हो जाए।केवल उच्चतम समरूपता वाले गंतव्य टेम्पलेट को प्रवर्धित किया जाएगा।इन उत्पादों का बाद के चक्रों में विस्तार जारी है, और प्रवर्धित गैर-विशिष्ट उत्पादों को बाहर कर दिया गया है।अवरोही पीसीआर उन तरीकों के लिए उपयोगी है जहां प्राइमर और लक्ष्य टेम्पलेट के बीच समरूपता की डिग्री ज्ञात नहीं है, जैसे एएफएलपी डीएनए फिंगरप्रिंटिंग।
संबंधित पीसीआर किट
2× पीसीआर हीरोTMमिक्स सिस्टम में सामान्य पीसीआर मिक्स सिस्टम की तुलना में पीसीआर अवरोधकों के प्रति अधिक सहनशीलता होती है, और यह विभिन्न जटिल टेम्पलेट्स के पीसीआर प्रवर्धन को आसानी से संभाल सकता है।अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणाली और उच्च दक्षता वाले टैक हीरो पीसीआर प्रतिक्रिया को उच्च प्रवर्धन दक्षता, विशिष्टता और संवेदनशीलता बनाते हैं।
उच्च प्रवर्धन दक्षता
इसमें 5'→3' डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि और 5'→3' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि है, 3'→5' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि के बिना।
रियल टाइम पीसीआर Easyᵀᴹ-SYBR ग्रीन आई किट
विशिष्ट-अनुकूलित बफर और हॉट-स्टार्ट टैक एंजाइम गैर-विशिष्ट प्रवर्धन और प्राइमर डिमर गठन को रोक सकता है
उच्च संवेदनशीलता-टेम्पलेट की कम प्रतियों का पता लगा सकती है
किट प्रतिक्रिया की प्रवर्धन दक्षता और विशिष्टता को प्रभावी ढंग से सुधारने के लिए एक अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणाली के साथ मिलकर एक अद्वितीय फोरेगीन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मक और फोरजीन हॉटस्टार टैक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करती है।
पोस्ट समय: मई-09-2023
