क्यूपीसीआर प्रयोगों में प्राइमर डिज़ाइन भी एक बहुत महत्वपूर्ण कड़ी है।प्राइमर उपयुक्त हैं या नहीं, इसका इस बात से गहरा संबंध है कि क्या प्रवर्धन दक्षता मानक तक पहुँचती है, क्या प्रवर्धित उत्पाद विशिष्ट हैं, और क्या प्रयोगात्मक परिणाम उपलब्ध हैं।
तो क्यूपीसीआर प्राइमर विशिष्टता को बेहतर कैसे बनाया जाए?उच्च प्रवर्धन दक्षता?
आज, हम आपको एक साथ क्यूपीसीआर प्राइमर डिजाइन करने के लिए ले जाएंगे, और क्यूपीसीआर प्राइमर डिजाइन को प्रयोगों में एक कुशल विद्या कौशल बनने देंगे।
क्यूपीसीआर प्राइमरों को डिज़ाइन करते समय, आमतौर पर निम्नलिखित बिंदुओं पर ध्यान दें: प्राइमरों को जितना संभव हो सके इंट्रॉन पर डिज़ाइन किया जाना चाहिए, उत्पाद की लंबाई 100-300 बीपी होनी चाहिए, टीएम मान जितना संभव हो 60 डिग्री सेल्सियस के करीब होना चाहिए, और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए, और प्राइमर का अंत जी या सी होना चाहिए, आदि प्रतीक्षा करें।
1. इंट्रोन्स में फैले प्राइमरों का डिज़ाइन
क्यूपीसीआर प्राइमरों को डिज़ाइन करते समय, इंट्रोन्स में डिज़ाइन किए गए प्राइमरों को चुनने से जीडीएनए टेम्पलेट को प्रवर्धित होने से रोका जा सकता है, और सभी उत्पाद सीडीएनए के प्रवर्धन से प्राप्त होते हैं, जिससे जीडीएनए संदूषण का प्रभाव समाप्त हो जाता है।
2. प्राइमर की लंबाई
प्राइमर की लंबाई आम तौर पर 18-30 एनटी के बीच होती है, और एम्प्लीफिकेशन उत्पाद की लंबाई को यथासंभव 100-300 बीपी के बीच नियंत्रित किया जाना चाहिए।
यदि प्राइमर बहुत छोटा है, तो यह गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को जन्म देगा, और यदि यह बहुत लंबा है, तो यह आसानी से द्वितीयक संरचना (जैसे हेयरपिन संरचना) बना देगा।यदि प्रवर्धन उत्पाद बहुत लंबा है, तो यह पोलीमरेज़ की प्रतिक्रिया के लिए उपयुक्त नहीं है, जो पीसीआर प्रवर्धन की दक्षता को प्रभावित करेगा।
3. जीसी सामग्री और टीएम मूल्य
प्राइमरों की जीसी सामग्री को 40% से 60% के बीच नियंत्रित किया जाना चाहिए।यदि यह बहुत अधिक या बहुत कम है, तो यह प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए अनुकूल नहीं है।समान टीएम मान और एनीलिंग तापमान प्राप्त करने के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों की जीसी सामग्री समान के करीब होनी चाहिए।
जहां तक ​​संभव हो टीएम मान 55-65 डिग्री सेल्सियस के बीच होना चाहिए, आम तौर पर 60 डिग्री सेल्सियस के आसपास, और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम का टीएम मान जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए, अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं।
4. प्राइमर के 3′ सिरे पर A का चयन करने से बचें
जब प्राइमर का 3′ सिरा बेमेल होता है, तो विभिन्न आधारों की संश्लेषण दक्षता में बहुत अंतर होता है।जब अंतिम आधार A होता है, तो यह बेमेल होने की स्थिति में भी श्रृंखला संश्लेषण शुरू कर सकता है, और जब अंतिम आधार T होता है, तो बेमेल प्रेरण की दक्षता बहुत कम हो जाती है।इसलिए, प्राइमर के 3′ सिरे पर A चुनने से बचने का प्रयास करें, और T चुनना बेहतर है।
यदि यह एक जांच प्राइमर है, तो जांच का 5′ सिरा G नहीं हो सकता है, क्योंकि जब एक G बेस FAM फ्लोरोसेंट रिपोर्टर समूह से जुड़ा होता है, तब भी G FAM समूह द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट सिग्नल को बुझा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गलत नकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।के जैसा लगना।
5. आधार वितरण
प्राइमर में चार आधारों का वितरण अधिमानतः यादृच्छिक है, 3′ सिरे पर लगातार 3 से अधिक G या C से परहेज करें, और लगातार 3 से अधिक से बचेंजीसी-समृद्ध अनुक्रम क्षेत्र में जी या सी युग्मन उत्पन्न करना आसान है।
6. प्राइमर डिज़ाइन क्षेत्र को जटिल माध्यमिक संरचनाओं से बचना चाहिए।
प्रवर्धन उत्पाद के एकल स्ट्रैंड द्वारा गठित द्वितीयक संरचना पीसीआर की सुचारू प्रगति को प्रभावित करेगी।लक्ष्य अनुक्रम में कोई द्वितीयक संरचना है या नहीं, इसकी पहले से भविष्यवाणी करके, प्राइमर के डिज़ाइन में इस क्षेत्र से बचने का प्रयास करें।
7. प्राइमरों को स्वयं और प्राइमरों के बीच लगातार पूरक आधारों से बचने का प्रयास करना चाहिए।
प्राइमर और प्राइमर के बीच लगातार 4 आधार संपूरकता नहीं हो सकती।प्राइमर में स्वयं एक पूरक अनुक्रम नहीं होना चाहिए, अन्यथा यह हेयरपिन संरचना बनाने के लिए खुद को मोड़ लेगा, जो प्राइमर और टेम्पलेट के एनीलिंग संयोजन को प्रभावित करेगा।
अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमरों के बीच पूरक अनुक्रम मौजूद नहीं हो सकते।प्राइमरों के बीच संपूरकता प्राइमर डिमर का उत्पादन करेगी, जो पीसीआर दक्षता को कम करेगी और यहां तक ​​कि मात्रात्मक सटीकता को भी प्रभावित करेगी।यदि प्राइमर-डिमर और हेयरपिन संरचनाएं अपरिहार्य हैं, तो △G मान बहुत अधिक नहीं होना चाहिए (4.5 kcal/mol से कम होना चाहिए)।
8. प्राइमर लक्ष्य विशिष्ट उत्पाद को बढ़ाते हैं।
क्यूपीसीआर जांच का अंतिम लक्ष्य लक्ष्य जीन की प्रचुरता को समझना है।यदि गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होता है, तो परिमाणीकरण गलत होगा।इसलिए, प्राइमरों को डिज़ाइन करने के बाद, उन्हें BLAST द्वारा परीक्षण करने की आवश्यकता होती है, और अनुक्रम डेटाबेस में उत्पादों की विशिष्टता की तुलना की जाती है।
इसके बाद, हम क्यूपीसीआर प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में मानव GAS6 (ग्रोथ अरेस्ट स्पेसिफिक 6) जीन लेते हैं।
01 क्वेरी जीन
होमो GAS6एनसीबीआई के माध्यम से।यहां, हमें यह सुनिश्चित करने के लिए जीन नाम और प्रजातियों की तुलना करने पर ध्यान देना चाहिए कि वे सुसंगत हैं।
02 जीन अनुक्रम ज्ञात करें
(1) यदि लक्ष्य अनुक्रम जीनोमिक डीएनए है, तो पहले वाले का चयन करें, जो जीन का जीनोमिक डीएनए अनुक्रम है।
(2) यदि लक्ष्य अनुक्रम एमआरएनए है, तो दूसरा चुनें।प्रवेश करने के बाद, नीचे दी गई तालिका में "सीडीएस" पर क्लिक करें।भूरे रंग की पृष्ठभूमि अनुक्रम जीन का कोडिंग अनुक्रम है।
03 डिज़ाइन प्राइमर
प्राइमर-ब्लास्ट इंटरफ़ेस दर्ज करें
ऊपर बाईं ओर फास्टा प्रारूप में जीन अनुक्रम संख्या या अनुक्रम दर्ज करें, और प्रासंगिक पैरामीटर भरें।

"प्राइमर प्राप्त करें" पर क्लिक करें और एनसीबीआई आपको यह बताने के लिए पॉप अप होगा कि इस तरह के पैरामीटर चयन को अन्य स्प्लिसिंग वेरिएंट में बढ़ाया जाएगा।हम अलग-अलग स्प्लिसिंग वेरिएंट की जांच कर सकते हैं और उचित प्राइमर जोड़ी प्राप्त करने के लिए उन्हें सबमिट कर सकते हैं (जैसा कि नीचे दिए गए चित्र में दिखाया गया है)।इस प्रक्रिया को चलने में दसियों सेकंड लग सकते हैं.
इन प्राइमर जोड़ियों का एनीलिंग तापमान लगभग 60°C होता है।प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार, प्रयोग के लिए मध्यम लंबाई, अच्छी विशिष्टता और कम आत्म-पूरक प्राइमरों वाले प्राइमरों का चयन करें, और सफलता दर काफी अधिक है!
04प्राइमर विशिष्टता सत्यापन
वास्तव में, प्राइमर डिज़ाइन करने के अलावा, प्राइमर-ब्लास्ट उन प्राइमरों का भी मूल्यांकन कर सकता है जिन्हें हमने स्वयं डिज़ाइन किया है।प्राइमर डिज़ाइन पृष्ठ पर लौटें, हमारे द्वारा डिज़ाइन किए गए अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर दर्ज करें, और अन्य पैरामीटर समायोजित नहीं किए जाएंगे।सबमिट करने के बाद, आप देख सकते हैं कि प्राइमर की जोड़ी अन्य जीनों पर भी मौजूद है या नहीं।यदि वे सभी उस जीन पर प्रदर्शित होते हैं जिसे हम बढ़ाना चाहते हैं, तो यह दर्शाता है कि प्राइमरों की इस जोड़ी की विशिष्टता बहुत बढ़िया है!(उदाहरण के लिए, यह प्राइमर क्वेरी का एकमात्र परिणाम है!)

05 प्राइमर गुणवत्ता निर्णय
किस प्रकार का प्राइमर "परफेक्ट" प्राइमर है जो "मानक तक प्रवर्धन दक्षता", "प्रवर्धित उत्पाद विशेषताओं" और "विश्वसनीय प्रयोगात्मक परिणाम" को जोड़ता है?
प्रवर्धन दक्षता

पिघलने की अवस्था
प्राइमरों की प्रवर्धन दक्षता 90%-110% तक पहुंच जाती है, जिसका अर्थ है कि प्रवर्धन दक्षता अच्छी है, और पिघलने वाले वक्र में एक शिखर होता है और आमतौर पर Tm>80°C होता है, जिसका अर्थ है कि प्रवर्धन विशिष्टता अच्छी है।
 
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