पता लगाने की विशिष्टता

ज्यादातर मामलों में, प्राइमर डिज़ाइन का उद्देश्य पीसीआर की विशिष्टता को अधिकतम करना है।यह कई चरों के कमोबेश पूर्वानुमानित प्रभाव से निर्धारित होता है।एक महत्वपूर्ण चर प्राइमर के 3′अंत पर अनुक्रम है।

महत्वपूर्ण रूप से, विशिष्टता के लिए डिज़ाइन किए गए पीसीआर परख व्यापक गतिशील रेंज पर उच्च दक्षता बनाए रखने की अधिक संभावना रखते हैं, क्योंकि परख गैर-विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों का उत्पादन नहीं करता है, जिससे पीसीआर अभिकर्मकों के साथ प्रतिस्पर्धा होती है या मुख्य प्रवर्धन प्रतिक्रिया बाधित होती है।

बेशक, कुछ मामलों में, विशिष्टता सबसे महत्वपूर्ण नहीं है, उदाहरण के लिए, जब लक्ष्य निकट से संबंधित लेकिन विभिन्न रोगजनकों की मात्रा निर्धारित करना है, तो विशेष डिजाइन, अनुकूलन और सत्यापन मानकों की आवश्यकता होती है।

पिघलने वाला वक्र एम्प्लीकॉन्स की विशिष्टता का आकलन करने के लिए एक मानक तरीका है, कम से कम इस संदर्भ में कि क्या किसी एकल लक्ष्य को बढ़ाना है।हालाँकि, इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि पिघलने वाले वक्र भ्रामक हो सकते हैं क्योंकि, उदाहरण के लिए, वे उप-इष्टतम प्राइमरों और कम टेम्पलेट सांद्रता के संयुक्त प्रभावों से प्रभावित हो सकते हैं।

P5 |पिघलने वाला वक्र दो लक्ष्य डीएनए की विभिन्न मात्राओं की दो जांचों से प्राप्त टीएम बदलाव को दर्शाता है।

उ. उच्च सांद्रता (विज्ञापन) पर, क्यूपीसीआर माप पूरा होने के बाद कोई स्पष्ट प्राइमर डिमर नहीं है।जैसे ही टेम्प्लेट सांद्रण 50 प्रतियों (ई) तक कम हो जाता है, एक गैर-विशिष्ट उत्पाद प्रकट होना शुरू हो जाता है और सबसे कम सांद्रण (एफ) पर एकमात्र उत्पाद बन जाता है।

बी. परीक्षण ने सभी लक्ष्य सांद्रता पर समान टीएमएस दर्ज किया, और सबसे कम सांद्रता (5 प्रतियां) पर भी कोई स्पष्ट प्राइमर डिमर नहीं था।इन दो पहचान विधियों का उपयोग करते समय, एनटीसी में कोई प्रवर्धन उत्पाद नहीं पाया गया।

P5 नमूनों से प्राप्त विघटन वक्र दिखाता है जिसमें टेम्पलेट विभिन्न सांद्रता में मौजूद है।पी 5 ए से पता चलता है कि दो सबसे कम सांद्रता पर, उत्पादित गैर-विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों का टीएमएस विशिष्ट एम्पलीकॉन्स की तुलना में कम है।

जाहिर है, इस पहचान पद्धति का उपयोग कम सांद्रता में मौजूद लक्ष्यों का पता लगाने के लिए विश्वसनीय रूप से नहीं किया जा सकता है।

दिलचस्प बात यह है कि एनटीसी, यानी, बिना डीएनए वाले नमूने, (गैर-विशिष्ट) प्रवर्धन उत्पादों को रिकॉर्ड नहीं करते हैं, जो दर्शाता है कि पृष्ठभूमि जीनोमिक डीएनए गैर-विशिष्ट प्रवर्धन/पोलीमराइजेशन में भाग ले सकता है।

कभी-कभी ऐसे पृष्ठभूमि प्राइमरों और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का समाधान नहीं किया जा सकता है, लेकिन अक्सर एक पहचान विधि को डिज़ाइन करना संभव होता है जिसमें किसी भी टेम्पलेट एकाग्रता और एनटीसी (पी 5 बी) में गैर-विशिष्ट प्रवर्धन नहीं होता है।

यहां, 35 के सीक्यू के साथ लक्ष्य एकाग्रता के प्रवर्धन को रिकॉर्ड करने से भी एक विशिष्ट विघटन वक्र उत्पन्न होगा।इसी तरह, एनटीसी ने गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कोई संकेत नहीं दिखाया।कभी-कभी, पता लगाने का व्यवहार मूल शराब पर निर्भर हो सकता है, और कुछ बफर रचनाओं में केवल गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का पता लगाया जाता है, जो विभिन्न एमजी2+ सांद्रता से संबंधित हो सकता है।

पता लगाने की स्थिरता

टा का अनुकूलन क्यूपीसीआर पता लगाने के अनुभवजन्य सत्यापन और अनुकूलन प्रक्रिया में एक उपयोगी कदम है।यह तापमान (या तापमान सीमा) दिखाकर प्राइमर सेट की मजबूती का प्रत्यक्ष संकेत प्रदान करता है जो एनटीसी को बढ़ाए बिना सबसे कम सीक्यू उत्पन्न करता है।

संवेदनशीलता में दो से चार गुना अंतर उच्च एमआरएनए अभिव्यक्ति वाले लोगों के लिए महत्वपूर्ण नहीं हो सकता है, लेकिन नैदानिक ​​​​परीक्षणों के लिए, इसका मतलब सकारात्मक और गलत नकारात्मक परिणामों के बीच अंतर हो सकता है।

क्यूपीसीआर प्राइमरों के टा गुण काफी भिन्न हो सकते हैं।कुछ परीक्षण बहुत मजबूत नहीं होते हैं, और यदि उन्हें प्राइमरों के इष्टतम टा मान के तहत नहीं किया जाता है, तो वे जल्दी ही नष्ट हो जाएंगे।

यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वास्तविक दुनिया में इस प्रकार का पता लगाना अक्सर समस्याग्रस्त होता है, और नमूने की शुद्धता, डीएनए की सांद्रता, या अन्य डीएनए की उपस्थिति इष्टतम नहीं हो सकती है।

इसके अलावा, लक्ष्य प्रतिलिपि संख्या एक विस्तृत श्रृंखला में भिन्न हो सकती है, और अभिकर्मक, प्लास्टिक के बर्तन, या उपकरण परीक्षण स्थापित करते समय उपयोग किए जाने वाले उपकरणों से भिन्न हो सकते हैं।

P6|तापमान प्रवणता पीसीआर पहचान की विभिन्न मजबूती को दर्शाती है।

ए. मानव मस्तिष्क आरएनए से तैयार सीडीएनए पर पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए बायोलिन के सेंसिफास्ट एसवाईबीआर मास्टरमिक्स (कैटलॉग नंबर बीआईओ-98050) का उपयोग करें।

बी. एपलीन के प्रवर्धन मानचित्र और विघटन वक्र (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG) को रिकॉर्ड करने के लिए बायो-रेड के सीएफएक्स क्यूपीसीआर उपकरण का उपयोग करें।

C. ACSBG1 का प्रवर्धन ग्राफ और पिघलने का वक्र (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG)।

डी. GFAP का प्रवर्धन ग्राफ और विघटन वक्र (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC)।

E. Cqs को अलग-अलग एनीलिंग तापमानों पर रिकॉर्ड किया गया, जो 7C तापमान प्रवणता के तहत दर्ज किए गए Cq में अंतर दर्शाता है।

पी 6 एक अवांछनीय परीक्षण का एक विशिष्ट परिणाम दिखाता है, जहां तीन मानव मस्तिष्क-विशिष्ट जीनों के लिए प्राइमरों का उपयोग करते हुए, 59सी और 67सी (पी 6ए) के बीच एक ग्रेडिएंट टीएएस का उपयोग करके क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया था।

प्रवर्धन ग्राफ से यह देखा जा सकता है कि ओपलिन प्राइमर आदर्श से बहुत दूर हैं क्योंकि उनकी इष्टतम टा रेंज बहुत संकीर्ण है (चित्रा 6 बी), यानी, सीक्यू व्यापक रूप से फैले हुए हैं, जिसके परिणामस्वरूप सीक्यू उनके इष्टतम सीक्यू लो की तुलना में काफी कम है।

यह पता लगाने की विधि अस्थिर है और इससे उप-इष्टतम प्रवर्धन हो सकता है।इसलिए, प्राइमर की इस जोड़ी को फिर से डिज़ाइन किया जाना चाहिए।इसके अलावा, पिघलने की अवस्था के विश्लेषण (इनसेट) से पता चलता है कि इस पता लगाने की विधि की विशिष्टता भी समस्याग्रस्त हो सकती है, क्योंकि प्रत्येक टा का पिघलने की अवस्था अलग है।

पी 6सी में दिखाई गई एसीएसबीजी1 पहचान विधि उपरोक्त ओपलिन पहचान विधि की तुलना में अधिक मजबूत है, लेकिन यह अभी भी आदर्श से बहुत दूर है, और संभावना है कि इसमें सुधार किया जा सकता है।

हालाँकि, हम इस बात पर जोर देते हैं कि मजबूती और विशिष्टता के बीच कोई आवश्यक संबंध नहीं है, क्योंकि इस पता लगाने की विधि द्वारा उत्पादित विघटन वक्र सभी टास (इनसेट) में समान शिखर मूल्य दिखाता है।

दूसरी ओर, मजबूती परीक्षण बहुत अधिक सहनशील है, जो टीएएस की एक विस्तृत श्रृंखला में समान सीक्यू उत्पन्न करता है, जैसा कि पी 6डी में दिखाए गए जीएफएपी परीक्षण में होता है।

समान 8 डिग्री सेल्सियस रेंज में प्राप्त सीक्यू में अंतर 1 से कम है, और विघटन वक्र (इनसेट) इस तापमान रेंज में पता लगाने की विशेषताओं की पुष्टि करता है।यह ध्यान देने योग्य है कि गणना की गई Tas और वास्तविक Ta सीमा बहुत भिन्न हो सकती है।

शोधकर्ताओं को कुशल प्राइमर डिज़ाइन करने में मदद करने के लिए कई दिशानिर्देश तैयार किए गए हैं, जिनमें से अधिकांश लंबे समय से स्थापित नियमों पर आधारित हैं और प्राइमर के 3′अंत पर बहुत अधिक ध्यान दिया गया है।अक्सर 3' सिरे पर एक G या C और दो G या C बेस (GC क्लैंप) शामिल करने की अनुशंसा की जाती है, लेकिन अंतिम 5 बेस में से दो से अधिक नहीं।

व्यवहार में, ये नियम शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन कर सकते हैं, लेकिन जरूरी नहीं कि वे सभी परिस्थितियों में सही हों।

P7 |प्राइमर के 3′अंत का विशिष्टता या दक्षता पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है।

A. मानव HIF-1α (NM_181054.2) जीन के लिए प्राइमरों की स्थिति।

बी. छह परीक्षण वस्तुओं को बढ़ाने के लिए एजिलेंट ब्रिलियंट III एसवाईबीआर ग्रीन मदर लिकर (कैट नंबर 600882) का उपयोग करें।

सी. बायो-रेड के सीएफएक्स क्यूपीसीआर उपकरण और 3′एंड प्राइमरों द्वारा रिकॉर्ड किया गया प्रवर्धन ग्राफ और पिघलने का वक्र।एनटीसी को लाल रंग में दिखाया गया है।

D. प्रत्येक परीक्षण आइटम का Cqs रिकॉर्ड

उदाहरण के लिए, पी 7 में परिणाम 3'अंत नियम का खंडन करता है।सभी डिज़ाइन मूल रूप से समान परिणाम देते हैं, केवल दो प्राइमर संयोजनों से एनटीसी में गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होता है।

हालाँकि, हम GC क्लिप के प्रभाव का समर्थन नहीं कर सकते, क्योंकि इस मामले में, A या T को अधिकतम 30 आधारों के रूप में उपयोग करने से विशिष्टता कम नहीं होती है।

टेस्ट सी, जहां एफ प्राइमर जीजीसीसी में समाप्त होता है, ने एनटीसी में सीक्यू रिकॉर्ड किया, यह दर्शाता है कि कोई 30-अंत में इन अनुक्रमों से बचना चाह सकता है।हम इस बात पर जोर देते हैं कि प्राइमर जोड़ी के सर्वोत्तम 3′अंत अनुक्रम को निर्धारित करने का एकमात्र तरीका कुछ उम्मीदवार प्राइमरों का प्रयोगात्मक रूप से मूल्यांकन करना है।

प्रवर्धन दक्षता

महत्वपूर्ण रूप से, हालांकि गैर-विशिष्ट पीसीआर पहचान कभी भी विशिष्ट नहीं हो सकती है, एंजाइम, मदर लिकर, एडिटिव्स और साइक्लिंग स्थितियों को बदलकर प्रवर्धन दक्षता को कई अलग-अलग तरीकों से समायोजित और अधिकतम किया जा सकता है।

पीसीआर पहचान की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के 10 या 5 गुना क्रमिक कमजोर पड़ने का उपयोग करना सबसे अच्छा है, अर्थात, "मानक वक्र विधि"।

यदि मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए पीसीआर एम्पलीकॉन्स या सिंथेटिक डीएनए लक्ष्यों का उपयोग किया जाता है, तो इन लक्ष्यों के क्रमिक कमजोर पड़ने को पृष्ठभूमि डीएनए (जैसे जीनोमिक डीएनए) की निरंतर मात्रा के साथ मिलाया जाना चाहिए।

P8 |पीसीआर की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए कमजोर पड़ने वाला वक्र।

A. पीसीआर और मेल्टिंग कर्व स्थितियों के लिए HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA और R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC और एगिलेंट ब्रिलियंट III SYBR ग्रीन मास्टरमिक्स (कैटलॉग नंबर 600882) के लिए प्राइमर का उपयोग करें।

बी. 100 एनजी आरएनए को रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया, 2 बार पतला किया गया, और क्रमिक रूप से पतला सीडीएनए नमूनों को 1 एनजी मानव जीनोमिक डीएनए में 5 बार पतला किया गया।पिघलने का वक्र इनसेट में दिखाया गया है।

C. दूसरे सीडीएनए नमूने के लिए आरटी प्रतिक्रिया, कमजोर पड़ने और क्रमिक कमजोर पड़ने को दोहराया गया, और परिणाम समान थे।

पी 8 दो मानक वक्र दिखाता है, दो अलग-अलग सीडीएनए नमूनों पर एक ही पता लगाने की विधि का उपयोग करते हुए, परिणाम समान दक्षता है, लगभग 100%, और आर2 मान भी समान है, अर्थात, प्रयोगात्मक डेटा और प्रतिगमन रेखा के बीच फिट की डिग्री या डेटा की रैखिकता की डिग्री।

दोनों मानक वक्र तुलनीय हैं, लेकिन बिल्कुल समान नहीं हैं।यदि उद्देश्य लक्ष्य को सटीक रूप से निर्धारित करना है, तो यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अनिश्चितता को समझाए बिना प्रतिलिपि संख्या गणना प्रदान करना अस्वीकार्य है

P9 |एक मानक वक्र का उपयोग करके परिमाणीकरण से जुड़ी माप अनिश्चितता.

A. पीसीआर और मेल्टिंग कर्व स्थितियों को निष्पादित करने के लिए GAPDH (NM_002046) के लिए प्राइमर का उपयोग करें।F: ACAGTTGCCATGTAGACC और R: TAACTGGTTGAGCACAGG और बायोलाइन का सेंसिफ़ास्ट SYBR मास्टरमिक्स (कैटलॉग नंबर BIO-98050)।

बी. बायो-रेड के सीएफएक्स क्यूपीसीआर उपकरण के साथ रिकॉर्ड किया गया प्रवर्धन चार्ट, पिघलने वाला वक्र और मानक वक्र।

सी. मानक वक्र ग्राफ़ और 95% विश्वास अंतराल (सीआई)।

डी. तनुकरण वक्र से प्राप्त तीन सीक्यू मानों की प्रतिलिपि संख्या और 95% विश्वास अंतराल।

पी 9 से पता चलता है कि एक अनुकूलित परीक्षण के लिए, एकल मानक वक्र की अंतर्निहित परिवर्तनशीलता लगभग 2 गुना (95% विश्वास अंतराल, न्यूनतम से अधिकतम) है, जो कि सबसे छोटी परिवर्तनशीलता हो सकती है जिसकी उम्मीद की जा सकती है।

संबंधित उत्पाद:

सेल डायरेक्ट आरटी क्यूपीसीआर किट

माउस टेल डायरेक्ट पीसीआर किट

पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट