आरटी-क्यूपीसीआर प्रयोग में आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता मूल्यांकन, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और क्यूपीसीआर तीन चरण शामिल हैं, प्रत्येक चरण में बहुत सारी सावधानियां हैं, हम नीचे विस्तार से परिचय देंगे।
Ⅰ.आरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन
आरटी-क्यूपीसीआर प्रयोग में, आरएनए निष्कर्षण के पूरा होने के बाद, आरएनए की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है, और इसके योग्य होने के बाद ही अनुवर्ती प्रयोग किया जा सकता है।मूल्यांकन विधियों में स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, एगिलेंट जेल वैद्युतकणसंचलन, एजिलेंट 2100 विश्लेषण शामिल हैं, जिनमें से सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन विधि का पता लगाना है।यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएनए एकाग्रता, शुद्धता और अखंडता का पता लगाने और विश्लेषण को पूरा करने के लिए इन दोनों तरीकों का एक साथ उपयोग करने की आवश्यकता है, ताकि आरएनए की गुणवत्ता सुनिश्चित की जा सके।
संबंधित आरएनए आइसोलेशन किट:
अत्यधिक शुद्ध और उच्च गुणवत्ता वाला कुल आरएनए 11 मिनट में विभिन्न सुसंस्कृत कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है।
विभिन्न जानवरों के ऊतकों से उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को जल्दी और कुशलता से निकालें।
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर:
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मुख्य रूप से आरएनए की एकाग्रता और शुद्धता निर्धारित करने के लिए किया जाता है, लेकिन यह आरएनए और जीनोमिक अवशेषों की अखंडता का पता नहीं लगा सकता है।उनमें से, A260/280 और A260/230 आरएनए शुद्धता का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं, और आरएनए शुद्धता का पता उनके मूल्यों के उतार-चढ़ाव के अनुसार लगाया जा सकता है:
1.9<ए260/280<2.1, यह दर्शाता है कि आरएनए शुद्धता अच्छी है;ए260/280<1.9, यह दर्शाता है कि आरएनए में प्रोटीन अवशेष हो सकता है;ए260/280>2.1, आरएनए के संभावित आंशिक क्षरण का संकेत देता है, जिसे एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा और अधिक पुष्टि की जा सकती है।
2. 2.0< A260/230< 2.2, यह दर्शाता है कि आरएनए शुद्धता अच्छी है;A260/230 <2.0, यह दर्शाता है कि आरएनए में कार्बनिक अभिकर्मकों के अवशेष हो सकते हैं, जैसे कि फिनोल, इथेनॉल या शर्करा।
एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन:
एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन परख आरएनए अखंडता, जीनोम और प्रोटीन अवशेषों का विश्लेषण कर सकती है, लेकिन आरएनए की एकाग्रता को सटीक रूप से निर्धारित नहीं कर सकती है या कार्बनिक अभिकर्मकों के अवशेषों का पता नहीं लगा सकती है।उदाहरण के लिए यूकेरियोटिक आरएनए टेम्पलेट लें:
1. आरएनए को एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया गया था।यदि जेल मानचित्र पर 28sRNA, 18sRNA और 5.8sRNA के केवल तीन एकल बैंड थे, तो यह इंगित करता है कि निकाला गया RNA बरकरार है।यदि खींचने की घटना होती है, तो यह आरएनए के आंशिक क्षरण को इंगित करता है।
2. यदि गोंद छेद और 28sRNA बैंड के बीच एक चमकीला बैंड है, तो जीनोमिक डीएनए अवशेष हो सकता है।
3. यदि गोंद छेद में बैंड दिखाई देते हैं, तो यह इंगित करता है कि प्रोटीन और अन्य मैक्रोमोलेक्यूलर पदार्थों के अवशेष हो सकते हैं।
Ⅱ. रिवर्स प्रतिलेखन
आरएनए निष्कर्षण पूरा होने के बाद, इसे बाद के प्रयोगों के लिए सीडीएनए में उलटने की आवश्यकता है, इसलिए उलटा कदम आवश्यक है।रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और प्राइमर के चयन से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन शुरू किया जाएगा:
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस चयन:
विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में AMV RTase और MMLV RTase शामिल हैं।AMV RTase के RNase H में मजबूत गतिविधि, कम संश्लेषण लंबाई, कम संश्लेषण मात्रा और अच्छी तापीय स्थिरता (42 ~ 55℃) है।MMLV RTase की RNase H गतिविधि कमजोर है, संश्लेषण की लंबाई लंबी है, संश्लेषण की मात्रा अधिक है, और थर्मल स्थिरता खराब है (37 ~ 42℃)।
क्योंकि RNase H एंजाइम में RNA टेम्पलेट को ख़राब करने का कार्य होता है, कमजोर RNase H गतिविधि वाले MMLV को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के दौरान अधिमानतः चुना जाना चाहिए, और बाद में आनुवंशिक इंजीनियरिंग के बाद, MMLV की थर्मल स्थिरता गुणात्मक छलांग तक पहुंच गई है।फोरजीन लेनाफोरेसी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए एम-एमएलवी) उदाहरण के तौर पर, यह आनुवंशिक पुनर्संयोजन तकनीक का उपयोग करके ई. कोली इंजीनियर्ड बैक्टीरिया में व्यक्त एक नया रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस है।यह एक पुनः संयोजक डीएनए पोलीमरेज़ है जो एकल-स्ट्रैंडेड आरएनए, डीएनए, या आरएनए: डीएनए हाइब्रिड से एक पूरक डीएनए स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है।इसमें कोई RNase H गतिविधि, मजबूत स्थिरता, मजबूत RNA आत्मीयता और उच्च पहचान संवेदनशीलता नहीं है।
फोरेसी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए एम-एमएलवी)
प्राइमर का चयन:
आम तौर पर आरटी प्राइमर तीन श्रेणियों में आते हैं: ऑलिगो डीटी, रैंडम प्राइमर और जीन-विशिष्ट प्राइमर।विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार उपयोग के लिए उपयुक्त प्राइमरों का चयन करें।
1. यदि टेम्प्लेट यूकेरियोटिक मूल का है और लेट सीडीएनए का उपयोग नियमित पीसीआर प्रवर्धन के लिए किया जाता है, तो ओलिगो (डीटी) की सिफारिश की जाती है;यदि अगला प्रयोग केवल क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किया जाता है, तो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की दक्षता में सुधार के लिए ओलिगो (डीटी) को यादृच्छिक प्राइमरों के साथ मिश्रित करने की सिफारिश की जाती है।
2. यदि टेम्प्लेट प्रोकैरियोट्स से है, तो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए रैंडम प्राइमर या जीन विशिष्ट प्राइमर का चयन किया जाना चाहिए।
Ⅲ.क्यूपीसीआर
प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव मुख्य रूप से मात्रात्मक तरीकों, प्राइमर डिजाइन सिद्धांतों, आरओएक्स चयन, प्रतिक्रिया प्रणाली विन्यास और प्रतिक्रिया स्थितियों की सेटिंग आदि के चयन से विस्तृत है।
मात्रात्मक तरीकों का चयन:
मात्रात्मक तरीकों को सापेक्ष मात्रात्मक तरीकों और पूर्ण मात्रात्मक तरीकों में विभाजित किया गया है।सापेक्ष परिमाणीकरण का उपयोग जीन अभिव्यक्ति पर कुछ उपचार विधियों के प्रभाव का पता लगाने, अलग-अलग समय पर जीन अभिव्यक्ति के अंतर का पता लगाने और विभिन्न ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति के अंतर की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।पूर्ण मात्रा का ठहराव वायरस में न्यूक्लिक एसिड की मात्रा आदि का पता लगा सकता है।प्रयोग करते समय हमें अपने प्रयोगों के अनुसार उचित मात्रात्मक तरीकों का चयन करना चाहिए।
प्राइमर डिज़ाइन सिद्धांत:
क्यूपीसीआर के लिए प्राइमर का डिज़ाइन सीधे प्रवर्धन दक्षता और उत्पाद विशिष्टता से संबंधित है।इसलिए, अच्छे प्राइमरों को सही ढंग से डिजाइन करना सफल क्यूपीसीआर का पहला कदम है।प्राइमर के डिज़ाइन में, पारंपरिक प्राइमर डिज़ाइन के सिद्धांत को पूरा करते समय निम्नलिखित सिद्धांतों पर ध्यान दिया जाना चाहिए:
1. लक्ष्य टुकड़े की लंबाई 100 और 300 बीपी के बीच नियंत्रित की जाती है;
2. जीनोमिक डीएनए के प्रभाव से बचने के लिए क्रॉस-एक्सॉन डिज़ाइन;
3. डिज़ाइन किए गए प्राइमरों को प्रवर्धन दक्षता के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता है, और केवल जब प्रवर्धन दक्षता मानक (90-110%) तक पहुंच जाती है, तो उन्हें मात्रात्मक प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है;
4. प्राइमर सांद्रता आमतौर पर 0.1uM और 1.0uM के बीच अनुकूलित होती है।
का चयनरॉक्स:
मात्रात्मक प्रतिक्रिया की प्रक्रिया में, आरओएक्स ऑप्टिकल पथ अंतर, पाइपिंग त्रुटि या वाष्पीकरण और संक्षेपण के कारण होने वाले वॉल्यूम अंतर को समान रूप से समायोजित कर सकता है, जिससे परिणामों की पुनरावृत्ति में सुधार होता है।हालाँकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ROX का चयन उपकरण से संबंधित है।यदि क्यूपीसीआर उपकरण में छिद्रों के बीच अंतर को स्वचालित रूप से ठीक करने का कार्य है, तो इसे आरओएक्स जोड़ने की आवश्यकता नहीं है;अन्यथा, इसमें ROX सुधार जोड़ने की आवश्यकता है।अभिकर्मकों को खरीदने में छोटे साझेदारों को सही आरओएक्स चुनने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण के अनुसार होना चाहिए, बाद में गलतियों से बचें।
प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी:
20ul और 50ul की प्रतिक्रिया मात्रा को प्राथमिकता दी जाती है।सिस्टम तैयार करते समय निम्नलिखित बातों पर ध्यान दिया जाना चाहिए:
1. प्रतिक्रिया प्रणाली को अल्ट्रा-क्लीन कार्यक्षेत्र, नए डीडीएच में वेंटिलेशन द्वारा तैयार करने की आवश्यकता है2प्रत्येक प्रयोग के लिए O का उपयोग किया जाता है;
2. प्रत्येक प्रयोग को यह सत्यापित करने के लिए एनटीसी तैयार करने की आवश्यकता है कि सिस्टम में प्रदूषण है या नहीं, और सिस्टम तैयार करते समय प्राइमर की प्रत्येक जोड़ी को एनटीसी करने की आवश्यकता है;
3. यह पता लगाने के लिए कि आरएनए टेम्पलेट में जीडीएनए अवशेष है या नहीं, पता लगाने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एनआरटी तैयार किया जा सकता है;
4. सिस्टम तैयार करते समय, एक नमूने के लिए कम से कम 3 तकनीकी दोहराव करने की सिफारिश की जाती है;
5. जब टेम्प्लेट सीडीएनए होता है, तो क्यूपीसीआर प्रयोग पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम के निषेध प्रभाव को कम करने के लिए इसे 5-10 बार पतला करने की सिफारिश की जाती है।ग्रेडिएंट द्वारा टेम्प्लेट मात्रा का पता लगाना बेहतर है, ताकि सीटी मान 20-30 के बीच रहे;
6. प्रतिक्रियाओं की आवश्यक संख्या निर्धारित करें, प्रतिक्रियाओं की संख्या के आधार पर 5-10% की वृद्धि करें, और वॉल्यूम कॉन्फ़िगरेशन संख्या की गणना करें;
7, सिस्टम को प्रीमिक्स सिद्धांत का उपयोग करके तैयार किया जाता है, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद मिश्रण किया जाता है और यह सुनिश्चित किया जाता है कि कोई बुलबुले न हों;
8, जहां तक संभव हो सहायक उपभोग्य सामग्रियों का चयन करें।
संबंधित आरटी-क्यूपीसीआर किट
किट प्रतिक्रिया की प्रवर्धन दक्षता और विशिष्टता को प्रभावी ढंग से सुधारने के लिए एक अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणाली के साथ मिलकर एक अद्वितीय फोरेगीन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मक और फोरजीन हॉटस्टार टैक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करती है।
पोस्ट करने का समय: अप्रैल-23-2023
