यह सर्वविदित है कि केंद्रीय हठधर्मिता में, आरएनए डीएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के बीच ट्रांसक्रिप्शनल मध्यस्थ है।डीएनए का पता लगाने की तुलना में, आरएनए का पता लगाना जीवों में जीन अभिव्यक्ति को अधिक निष्पक्ष रूप से प्रतिबिंबित कर सकता है।आरएनए से जुड़े प्रयोगों में शामिल हैं: क्यूआरटी-पीसीआर, आरएनए-सेक, और फ्यूजन जीन का पता लगाना, आदि। आरएनए की विशेषताओं के आधार पर (आरएनए की चीनी रिंग में डीएनए की चीनी रिंग की तुलना में एक अधिक मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूह होता है), पर्यावरण में बड़ी संख्या में आरएनएएस के साथ मिलकर, आरएनए डीएनए की तुलना में अधिक अस्थिर और आसानी से नष्ट हो जाता है।कचरा अंदर, कचरा बाहर, यदि आरएनए की गुणवत्ता अच्छी नहीं है, तो प्रयोगात्मक परिणाम असंतोषजनक होंगे, विशेष रूप से गलत डेटा या खराब दोहराव के रूप में प्रकट होंगे।इसलिए, आरएनए के प्रसंस्करण पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए, और बाद के प्रयोगात्मक डेटा की सटीकता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण का लिंक भी अधिक महत्वपूर्ण है।

आरएनए की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, आमतौर पर निम्नलिखित विधियाँ उपयोग की जाती हैं:

• स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री
• अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन
• एजिलेंट बायोएनालाइज़र
• वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर
• क्यूबिट फ्लोरोसेंट डाई विधि

01 स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री

आरएनए में संयुग्मित दोहरे बंधन होते हैं और 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण शिखर होता है।लैंबर्ट-बीयर के नियम के अनुसार, हम 260 एनएम पर अवशोषण शिखर से आरएनए एकाग्रता की गणना कर सकते हैं।इसके अलावा, हम 260nm, 280nm और 230nm अवशोषण शिखर के अनुपात के अनुसार RNA की शुद्धता की गणना भी कर सकते हैं।280 एनएम और 230 एनएम क्रमशः प्रोटीन और छोटे अणुओं के अवशोषण शिखर हैं।योग्य आरएनए शुद्धता के A260/A280 और A260/A230 का अनुपात 2 से अधिक होना चाहिए। यदि यह 2 से कम है, तो इसका मतलब है कि आरएनए नमूने में प्रोटीन या छोटे अणु संदूषण है और इसे फिर से शुद्ध करने की आवश्यकता है।संदूषण स्रोत डाउनस्ट्रीम प्रयोगों को प्रभावित करेंगे, जैसे कि पीसीआर प्रतिक्रियाओं की प्रवर्धन दक्षता को बाधित करना, जिसके परिणामस्वरूप गलत मात्रात्मक परिणाम होंगे।आरएनए की शुद्धता का बाद के परिणामों पर बहुत प्रभाव पड़ता है, इसलिए न्यूक्लिक एसिड प्रयोगों में पहले चरण में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री आम तौर पर एक अनिवार्य गुणवत्ता नियंत्रण लिंक है।

चित्र 1. विशिष्ट आरएनए/डीएनए अवशोषण स्पेक्ट्रम

02 अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन

शुद्धता के अलावा, आरएनए की अखंडता भी आरएनए की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है।आरएनए के क्षरण से नमूने में बड़ी संख्या में छोटे टुकड़े हो जाएंगे, इसलिए प्रभावी ढंग से पहचाने जा सकने वाले और संदर्भ अनुक्रम द्वारा कवर किए जा सकने वाले आरएनए टुकड़ों की संख्या कम हो जाएगी।आरएनए अखंडता की जांच 1% एगरोज़ जेल पर कुल आरएनए के वैद्युतकणसंचलन द्वारा की जा सकती है।यह विधि जेल को स्वयं कॉन्फ़िगर कर सकती है, या अखंडता परीक्षण के लिए पूर्वनिर्मित ई-जेल™ सिस्टम का उपयोग कर सकती है।कुल आरएनए का 80% से अधिक राइबोसोमल आरएनए है, जिसका अधिकांश भाग 28एस और 18एस आरआरएनए (स्तनधारी प्रणालियों में) से बना है।अच्छी गुणवत्ता वाला आरएनए दो स्पष्ट चमकीली पट्टियाँ दिखाएगा, जो क्रमशः 5 Kb और 2 Kb पर 28S और 18S चमकीली पट्टियाँ हैं, और अनुपात 2:1 के करीब होगा।यदि यह फैली हुई अवस्था में है, तो इसका मतलब है कि आरएनए नमूना ख़राब हो गया है, और आरएनए की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए बाद में वर्णित विधि का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।

चित्र 2. अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन पर अवक्रमित (लेन 2) और अक्षुण्ण आरएनए (लेन 3) की तुलना

03 एजिलेंट बायोएनालाइजर

ऊपर वर्णित एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन विधि के अलावा, जो हमें आरएनए की अखंडता को आसानी से और जल्दी से पहचानने में मदद कर सकती है, हम आरएनए की अखंडता को निर्धारित करने के लिए एगिलेंट बायोएनालाइजर का भी उपयोग कर सकते हैं।यह आरएनए एकाग्रता और अखंडता का आकलन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स, केशिका वैद्युतकणसंचलन और प्रतिदीप्ति के संयोजन का उपयोग करता है।आरएनए नमूने की प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए अंतर्निहित एल्गोरिदम का उपयोग करके, एगिलेंट बायोएनालाइज़र एक संदर्भ आरएनए अखंडता मूल्य, आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (इसके बाद आरआईएन के रूप में संदर्भित) की गणना कर सकता है [1]।आरआईएन का मूल्य जितना बड़ा होगा, आरएनए की अखंडता उतनी ही अधिक होगी (1 अत्यंत ख़राब है, 10 सबसे पूर्ण है)।आरएनए से जुड़े कुछ प्रयोग गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक पैरामीटर के रूप में आरआईएन का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।एक उदाहरण के रूप में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रयोगों (इसके बाद एनजीएस के रूप में संदर्भित) को लेते हुए, ऑनकोमाइन™ ह्यूमन इम्यून रिपर्टोयर के दिशानिर्देश, जिसका उपयोग थर्मो फिशर के ऑनकोमाइन पैनल श्रृंखला में बी सेल और टी सेल एंटीजन रिसेप्टर्स का पता लगाने के लिए किया जाता है, सुझाव देते हैं कि 4 से अधिक आरआईएन मान वाले नमूने, अधिक प्रभावी रीड्स और क्लोन को मापा जा सकता है (चित्रा 3)।विभिन्न पैनलों के लिए अलग-अलग अनुशंसित श्रेणियां हैं, और अक्सर एक उच्च आरआईएन अधिक प्रभावी डेटा ला सकता है।

चित्र 3, ऑनकोमाइन™ ह्यूमन इम्यून रिपर्टोयर प्रयोगों में, 4 से अधिक आरआईएन वाले नमूने अधिक प्रभावी रीड्स और टी सेल क्लोन का पता लगा सकते हैं।【2】

हालाँकि, RIN मान की कुछ सीमाएँ भी हैं।यद्यपि आरआईएन का एनजीएस प्रयोगात्मक डेटा की गुणवत्ता के साथ उच्च संबंध है, यह एफएफपीई नमूनों के लिए उपयुक्त नहीं है।एफएफपीई नमूनों का लंबे समय से रासायनिक उपचार किया गया है, और निकाले गए आरएनए में आमतौर पर अपेक्षाकृत कम आरआईएन मूल्य होता है।हालाँकि, इसका मतलब यह नहीं है कि प्रयोग का प्रभावी डेटा असंतोषजनक होना चाहिए।एफएफपीई नमूनों की गुणवत्ता का सटीक आकलन करने के लिए, हमें आरआईएन के अलावा अन्य मापों का उपयोग करने की आवश्यकता है।आरआईएन के अलावा, एगिलेंट बायोएनालाइजर आरएनए गुणवत्ता के मूल्यांकन पैरामीटर के रूप में डीवी200 मूल्य की भी गणना कर सकता है।DV200 एक पैरामीटर है जो आरएनए नमूने में 200 बीपी से बड़े टुकड़ों के अनुपात की गणना करता है।DV200 RIN की तुलना में FFPE नमूना गुणवत्ता का बेहतर संकेतक है।एफएफपीई द्वारा निकाले गए आरएनए के लिए, इसका प्रभावी ढंग से पता लगाए जा सकने वाले जीनों की संख्या और जीन की विविधता के साथ बहुत उच्च संबंध है [3]।हालाँकि DV200 एफएफपीई की गुणवत्ता का पता लगाने में कमियों को पूरा कर सकता है, लेकिन एगिलेंट बायोएनालाइज़र अभी भी आरएनए नमूनों में गुणवत्ता की समस्याओं का व्यापक विश्लेषण नहीं कर सकता है, जिसमें यह भी शामिल है कि नमूनों में अवरोधक हैं या नहीं।अवरोधक स्वयं डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की प्रवर्धन दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं और उपयोगी डेटा की मात्रा को कम कर सकते हैं।यह जानने के लिए कि क्या नमूने में कोई अवरोधक है, हम आगे वर्णित वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर विधि को अपना सकते हैं।

04 वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर

वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर विधि न केवल नमूने में अवरोधकों का पता लगा सकती है, बल्कि एफएफपीई नमूने में आरएनए की गुणवत्ता को भी सटीक रूप से प्रतिबिंबित कर सकती है।एजिलेंट जैविक विश्लेषकों की तुलना में, वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक उपकरण अपने व्यापक अनुप्रयोग के कारण प्रमुख जैविक प्रयोगशालाओं में अधिक लोकप्रिय हैं।आरएनए नमूनों की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए, हमें केवल आंतरिक संदर्भ जीन, जैसे जीयूएसबी (कैट नंबर एचएस00939627) के लिए प्राइमर जांच खरीदने या तैयार करने की आवश्यकता है।पूर्ण मात्रात्मक प्रयोगों का संचालन करने के लिए प्राइमरों, जांच और मानकों (ज्ञात एकाग्रता का कुल आरएनए) के इस सेट का उपयोग करके, प्रभावी आरएनए टुकड़ा एकाग्रता की गणना आरएनए गुणवत्ता के मूल्यांकन मानक (संक्षेप में कार्यात्मक आरएनए मात्रा (एफआरक्यू)) के रूप में की जा सकती है।एनजीएस परीक्षण में, हमने पाया कि आरएनए नमूनों की एफआरक्यू का प्रभावी डेटा वॉल्यूम के साथ बहुत अधिक सहसंबंध है।0.2एनजी/यूएल एफआरक्यू से अधिक सभी नमूनों के लिए, कम से कम 70% रीड्स संदर्भ अनुक्रम को प्रभावी ढंग से कवर कर सकते हैं (चित्र 4)।

चित्र 4, प्रतिदीप्ति मात्रात्मक विधि द्वारा पता लगाए गए FRQ मान का एनजीएस प्रयोग में प्राप्त प्रभावी डेटा के साथ बहुत उच्च सहसंबंध (R2>0.9) है।लाल रेखा FRQ मान 0.2 एनजी/यूएल (लॉग10 = -0.7) के बराबर है।【4】

एफएफपीई नमूनों पर लागू होने के अलावा, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर विधि नमूनों में अवरोधकों की प्रभावी ढंग से निगरानी भी कर सकती है।हम आंतरिक सकारात्मक नियंत्रण (आईपीसी) और उसके परख के साथ प्रतिक्रिया प्रणाली में पता लगाने के लिए नमूना जोड़ सकते हैं, और फिर सीटी मान प्राप्त करने के लिए प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव कर सकते हैं।यदि नो-सैंपल प्रतिक्रिया में सीटी मान सीटी मान से पीछे है, तो यह इंगित करता है कि अवरोधक नमूने में मौजूद है और प्रतिक्रिया में प्रवर्धन दक्षता को रोकता है।

05 क्यूबिट फ्लोरोसेंट डाई विधि

क्यूबिट फ्लोरोमीटर न्यूक्लिक एसिड सांद्रता और शुद्धता का पता लगाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला छोटा उपकरण है, जिसे संचालित करना आसान है और लगभग हर आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला में मौजूद है।यह न्यूक्लिक एसिड-बाइंडिंग फ्लोरोसेंट डाई (क्यूबिट डिटेक्शन रिएजेंट) का पता लगाकर और न्यूक्लिक एसिड की सांद्रता की सटीक गणना करता है।क्यूबिट में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है, और यह आरएनए को पीजी/माइक्रोएल सांद्रता तक सटीक रूप से माप सकता है।न्यूक्लिक एसिड सांद्रता को सटीक रूप से मापने की प्रसिद्ध क्षमता के अलावा, थर्मो फिशर का नवीनतम नया मॉडल, क्यूबिट 4.0, आरएनए की अखंडता का भी पता लगा सकता है।क्यूबिट 4.0 का आरएनए डिटेक्शन सिस्टम (आरएनए आईक्यू परख) एक साथ दो विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों का पता लगाकर आरएनए की अखंडता का पता लगाता है।ये दो फ्लोरोसेंट रंग क्रमशः आरएनए के बड़े टुकड़ों और छोटे टुकड़ों से जुड़ सकते हैं।ये दो फ्लोरोसेंट रंग नमूने में आरएनए के बड़े टुकड़ों के अनुपात को दर्शाते हैं, और इससे आरएनए गुणवत्ता का प्रतिनिधित्व करने वाले आईक्यू (अखंडता और गुणवत्ता) मूल्य की गणना की जा सकती है।आईक्यू मान एफएफपीई और गैर-एफएफपीई दोनों नमूनों पर लागू होता है, और बाद की अनुक्रमण गुणवत्ता पर इसका काफी प्रभाव पड़ता है।उदाहरण के तौर पर एनजीएस प्रयोगों को लेते हुए, आयन टोरेंट™ प्लेटफॉर्म पर किए गए आरएनए-सेक परीक्षण प्रयोगों में, 4 से अधिक आईक्यू मान वाले अधिकांश नमूनों में कम से कम 50% प्रभावी रीडिंग थी (चित्र 5)।उपर्युक्त पता लगाने के तरीकों की तुलना में, क्यूबिट आईक्यू परख न केवल संचालित करने के लिए अधिक सुविधाजनक है और इसमें कम समय (पांच मिनट के भीतर) लगता है, बल्कि मापा पैरामीटर आईक्यू मान और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की डेटा गुणवत्ता के बीच एक बड़ा संबंध भी है।

चित्र 5, क्यूबिट आरएनए आईक्यू मान और आरएनए-सेक के मैप किए गए रीड्स के बीच एक बड़ा संबंध है।【5】

उपरोक्त परिचय के माध्यम से, मेरा मानना ​​है कि हर किसी को विभिन्न आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण विधियों की पर्याप्त समझ है।व्यवहार में, आप चुन सकते हैंनमूना प्रकार और मौजूदा उपकरणों के अनुसार संबंधित विधि।केवल आरएनए की गुणवत्ता को अच्छी तरह से नियंत्रित करके ही हम खराब नमूना गुणवत्ता के कारण होने वाले बाद के प्रयोगों की विफलता से बच सकते हैं, जिससे कीमती समय, ऊर्जा और लागत की बचत होगी।

संदर्भ उत्पाद:

पशु कुल आरएनए अलगाव किट

सेल टोटल आरएनए आइसोलेशन किट

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

【1】श्रोएडर, ए., म्यूएलर, ओ., स्टॉकर, एस. एट अल।आरआईएन: आरएनए मापों के लिए अखंडता मान निर्दिष्ट करने के लिए एक आरएनए अखंडता संख्या।बीएमसी मॉलिक्यूलर बायोल 7, 3 (2006)।https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ऑनकोमाइन ह्यूमन इम्यून रिपर्टोयर यूजर गाइड (पब. नं. MAN0017438 Rev. C.0)।

【3】लिआ सी वेहमास, चार्ल्स ई वुड, ब्रायन एन चोर्ले, कैरोल एल यौक, गेल एम नेल्सन, सुसान डी हेस्टर, अभिलेखीय फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों से प्राप्त आरएनए का आकलन करने के लिए उन्नत गुणवत्ता मेट्रिक्स, टॉक्सिकोलॉजिकल साइंसेज, खंड 170, अंक 2, अगस्त 2019, पृष्ठ 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/