पिपेट टिप और ईपी ट्यूब आदि का बंध्याकरण।

1. विआयनीकृत पानी के साथ 0.1% (एक हजारवां) डीईपीसी (अत्यधिक जहरीला पदार्थ) तैयार करें, इसे धूआं हुड में सावधानी से उपयोग करें, और इसे प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस दूर स्टोर करें;

डीईपीसी पानी शुद्ध पानी है जिसे डीईपीसी से उपचारित किया जाता है और उच्च तापमान और उच्च दबाव द्वारा निष्फल किया जाता है।RNase, DNase और प्रोटीनेज़ से मुक्त होने के लिए परीक्षण किया गया।

2. पिपेट टिप और ईपी ट्यूब को 0.1% डीईपीसी में डालें, और सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप और ईपी ट्यूब 0.1% डीईपी से भरे हुए हैं।

3. प्रकाश से बचाएं, रात भर खड़े रहने दें (12-24 घंटे)

4. टिप और ईपी ट्यूब वाले बॉक्स को डीईपीसी में भिगोने की जरूरत नहीं है।टिप या ईपी ट्यूब में डीईपीसी पानी को मोटे तौर पर निकालने के बाद इसे पैक करके लपेट दें।

5. 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट

6. 180 डिग्री सेल्सियस, कई घंटों तक सूखा (कम से कम 3 घंटे)

नोट: ए.डीईपीसी संभालते समय लेटेक्स दस्ताने और मास्क पहनें!बी, या डीईपीसी नसबंदी के बिना, 130 ℃, 90 मिनट आटोक्लेव (कई प्रयोगशालाएं उच्च तापमान नसबंदी दो बार)

आरएनए निष्कर्षण विचार

ऊतक आरएनए अलगाव विफलता की दो प्रमुख घटनाएं

आरएनए क्षरण और ऊतकों में अशुद्धियों के अवशेष,गिरावट के संबंध में, आइए पहले देखें कि संवर्धित कोशिकाओं से निकाला गया आरएनए आसानी से क्यों नष्ट नहीं होता है।मौजूदा आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों में ऐसे घटक होते हैं जो तेजी से आरएनएएस को रोकते हैं।संवर्धित कोशिकाओं में लाइसेट मिलाएं, और बस इसे मिलाएं, सभी कोशिकाओं को लाइसेट के साथ अच्छी तरह से मिलाया जा सकता है, और कोशिकाएं पूरी तरह से लाइज़ हो जाती हैं।कोशिकाओं के लाइज़ होने के बाद, लाइसेट में सक्रिय तत्व तुरंत इंट्रासेल्युलर RNase को रोकते हैं, जिससे RNA बरकरार रहता है।कहने का तात्पर्य यह है, क्योंकि संवर्धित कोशिकाएं लाइसेट के साथ आसानी से और पूरी तरह से संपर्क में रहती हैं, इसलिए उनका आरएनए आसानी से नष्ट नहीं होता है;दूसरी ओर, ऊतक में आरएनए आसानी से नष्ट हो जाता है क्योंकि ऊतक की कोशिकाओं के लिए लाइसेट से जल्दी संपर्क करना आसान नहीं होता है।पर्याप्त संपर्क के कारण.इसलिए,यह मानते हुए कि आरएनए गतिविधि को बाधित करते हुए ऊतक को एक कोशिका में बदलने का एक तरीका है, गिरावट की समस्या पूरी तरह से हल हो सकती है।

तरल नाइट्रोजन मिलिंग ऐसी सबसे प्रभावी विधि है।हालाँकि, तरल नाइट्रोजन मिलिंग विधि बहुत परेशानी वाली है, खासकर जब नमूनों की संख्या बड़ी हो।इसने अगली सबसे अच्छी चीज़ को जन्म दिया: होमोजेनाइज़र।समरूप बनानेवालाविधि इस सवाल पर विचार नहीं करती है कि कोशिकाओं के लाइसेट के संपर्क में आने से पहले RNase गतिविधि कैसे बाधित होती है, बल्कि यह प्रार्थना करती है कि ऊतक विघटन की दर उस दर से तेज हो जिस पर इंट्रासेल्युलर RNase RN को ख़राब करता है।

इलेक्ट्रिक होमोजेनाइज़र का प्रभाव बेहतर है,और ग्लास होमोजेनाइज़र का प्रभाव खराब है, लेकिन सामान्य तौर पर, होमोजेनाइज़र विधि गिरावट की घटना को नहीं रोक सकती है।इसलिए, यदि निष्कर्षण ख़राब हो गया है, तो तरल नाइट्रोजन के साथ पीसने के लिए मूल इलेक्ट्रिक होमोजेनाइज़र का उपयोग किया जाना चाहिए;मूल ग्लास होमोजेनाइज़र को इलेक्ट्रिक होमोजेनाइज़र में बदला जाना चाहिए या सीधे तरल नाइट्रोजन के साथ मिलाया जाना चाहिए।समस्या लगभग 100% संभव है.समाधान करें.

बाद के प्रयोगों को प्रभावित करने वाली अशुद्धता अवशेष समस्या के कारण गिरावट की तुलना में अधिक विविध हैं, और समाधान तदनुसार भिन्न हैं।निष्कर्ष के तौर पर,यदि ऊतक में गिरावट या अवशिष्ट अशुद्धियाँ हैं, तो विशिष्ट प्रायोगिक सामग्री के लिए निष्कर्षण विधि/अभिकर्मक को अनुकूलित किया जाना चाहिए।आपको अनुकूलन के लिए अपने कीमती नमूनों का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं है: आप बाजार से मछली/मुर्गी जैसे कुछ छोटे जानवर खरीद सकते हैं, सामग्री का संबंधित हिस्सा आरएनए निष्कर्षण के लिए ले सकते हैं, और दूसरा हिस्सा प्रोटीन निष्कर्षण के लिए ले सकते हैं - मुंह, पेट और आंतों के अर्क के साथ पीस लें।

निकाले गए आरएनए के लक्ष्य आरएनए का उपयोग विभिन्न अनुवर्ती प्रयोगों के लिए किया जाता है, और इसकी गुणवत्ता की आवश्यकताएं अलग-अलग होती हैं

सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण के लिए एंजाइम प्रतिक्रिया अवरोधकों के अवशेषों के बिना आरएनए अखंडता की आवश्यकता होती है;उत्तरी को उच्च आरएनए अखंडता और एंजाइम प्रतिक्रिया अवरोधक अवशेषों के लिए कम आवश्यकताओं की आवश्यकता होती है;आरटी-पीसीआर को बहुत अधिक आरएनए अखंडता की आवश्यकता नहीं होती है,लेकिन एंजाइम प्रतिक्रियाओं को रोकता है।अवशेषों की आवश्यकताएं सख्त हैं।इनपुट आउटपुट निर्धारित करता है;हर बार लक्ष्य उच्चतम शुद्धता वाला आरएनए प्राप्त करना है, इसमें लोगों और धन दोनों का खर्च आएगा।

नमूनों का संग्रहण/भंडारण

गिरावट को प्रभावित करने वाले कारक नमूने के जीवित शरीर/या मूल विकास वातावरण को छोड़ने के बाद, नमूने में अंतर्जात एंजाइम आरएनए को ख़राब करना शुरू कर देंगे,और गिरावट की दर अंतर्जात एंजाइमों की सामग्री और तापमान से संबंधित है।परंपरागत रूप से, अंतर्जात एंजाइम गतिविधि को पूरी तरह से बाधित करने के केवल दो तरीके हैं: तुरंत लाइसेट जोड़ें और पूरी तरह से और तेजी से समरूपीकरण करें;छोटे टुकड़ों में काटें और तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमा दें।दोनों दृष्टिकोणों के लिए तेज़ संचालन की आवश्यकता होती है।उत्तरार्द्ध सभी नमूनों के लिए उपयुक्त है, जबकि पूर्व केवल कोशिकाओं और अंतर्जात एंजाइमों की कम सामग्री वाले ऊतकों के लिए उपयुक्त है और समरूप बनाना आसान है।विशेष रूप से, पौधे के ऊतक, यकृत, थाइमस, अग्न्याशय, प्लीहा, मस्तिष्क, वसा, मांसपेशी ऊतक, आदि को आगे बढ़ने से पहले तरल नाइट्रोजन के साथ सबसे अच्छा जमाया जाता है।

नमूनों का विखंडन और समरूपीकरण

गिरावट और उपज को प्रभावित करने वाले कारक नमूना विखंडन हैसंपूर्ण समरूपीकरण के लिए, जो आरएनए की पूर्ण और पूर्ण रिहाई के लिए है।कोशिकाओं को बिना टूटे सीधे समरूप बनाया जा सकता है।ऊतकों को टूटने के बाद ही एकरूप बनाया जा सकता है।यीस्ट और बैक्टीरिया को समरूप बनाने से पहले उन्हें संबंधित एंजाइमों से तोड़ने की आवश्यकता होती है।कम अंतर्जात एंजाइम सामग्री और आसान समरूपीकरण वाले ऊतकों को एक होमोजेनाइज़र द्वारा लाइसेट में एक समय में कुचल और समरूप बनाया जा सकता है;पौधे के ऊतक, यकृत, थाइमस, अग्न्याशय, प्लीहा, मस्तिष्क, वसा, मांसपेशी ऊतक और अन्य नमूने, वे या तो अंतर्जात एंजाइमों में उच्च हैं या आसानी से समरूप नहीं होते हैं,इसलिए ऊतक विघटन और समरूपीकरण अलग से किया जाना चाहिए.विखंडन की सबसे विश्वसनीय और सबसे उत्पादक विधि तरल नाइट्रोजन के साथ मिलिंग है, और समरूपीकरण की सबसे विश्वसनीय विधि एक इलेक्ट्रिक होमोजेनाइज़र का उपयोग है।तरल नाइट्रोजन के साथ मिलिंग के बारे में एक विशेष नोट: पूरी मिलिंग प्रक्रिया के दौरान नमूने को पिघलाया नहीं जाना चाहिए, क्योंकि जमे हुए होने पर अंतर्जात एंजाइमों के कार्य करने की अधिक संभावना होती है।

लाइसेट का चयन

ऑपरेशन की सुविधा और अवशिष्ट अंतर्जात अशुद्धियों के कारकों को प्रभावित करने वाले आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले लिसिस समाधान आरएनएएस की गतिविधि को लगभग बाधित कर सकते हैं।इसलिए, लिसिस समाधान चुनने का मुख्य बिंदु शुद्धिकरण विधि के साथ संयोजन पर विचार करना है।एक अपवाद है:उच्च अंतर्जात एंजाइम सामग्री वाले नमूनों में अंतर्जात एंजाइमों को निष्क्रिय करने की क्षमता बढ़ाने के लिए फिनोल युक्त लाइसेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

शुद्धिकरण विधि का चयन

अवशिष्ट अंतर्जात अशुद्धियों को प्रभावित करने वाले कारक, निष्कर्षण गति कोशिकाओं जैसे स्वच्छ नमूनों के लिए, उपलब्ध लगभग किसी भी शुद्धिकरण विधि से संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।लेकिन कई अन्य नमूनों के लिए, विशेष रूप से जिनमें पौधों, यकृत, बैक्टीरिया आदि जैसे उच्च स्तर की अशुद्धियाँ हैं, एक उपयुक्त शुद्धिकरण विधि चुनना महत्वपूर्ण है।स्तंभ केन्द्रापसारक शुद्धि विधि में तेज़ निष्कर्षण गति होती है और आरएनए की बाद की एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को प्रभावित करने वाली अशुद्धियों को प्रभावी ढंग से हटा सकती है, लेकिन यह महंगी है (फोरजीन लागत प्रभावी किट की पेशकश कर सकती है, अधिक विवरण के लिए क्लिक करें)यहाँ);किफायती और क्लासिक शुद्धिकरण विधियों, जैसे कि LiCl वर्षा, का उपयोग करके भी संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं, लेकिन ऑपरेशन का समय लंबा है।.

आरएनए निष्कर्षण के लिए "तीन अनुशासन और आठ ध्यान"।

अनुशासन 1:बहिर्जात एंजाइमों के प्रदूषण को समाप्त करें।

नोट 1:मास्क और दस्ताने सख्ती से पहनें।

नोट 2:प्रयोग में शामिल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, टिप हेड, पिपेट रॉड, इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक और प्रायोगिक बेंचों का पूरी तरह से निपटान किया जाना चाहिए।

नोट 3:प्रयोग में शामिल अभिकर्मक/समाधान, विशेष रूप से पानी, RNase-मुक्त होना चाहिए।

अनुशासन 2:अंतर्जात एंजाइमों की गतिविधि को अवरुद्ध करें

नोट 4:एक उपयुक्त समरूपीकरण विधि चुनें.

नोट 5:एक उपयुक्त लाइसेट चुनें.

नोट 6:नमूने की आरंभिक मात्रा को नियंत्रित करें.

अनुशासन 3:अपना निष्कर्षण उद्देश्य स्पष्ट करें

नोट 7:किसी भी लाइसेट प्रणाली के नमूने की अधिकतम शुरुआती मात्रा के करीब पहुंचने पर, निष्कर्षण की सफलता दर तेजी से गिर जाती है।

नोट 8:सफल आरएनए निष्कर्षण के लिए एकमात्र आर्थिक मानदंड बाद के प्रयोगों में सफलता है, न कि उपज।

RNase संदूषण के शीर्ष 10 स्रोत

1. उंगलियां बहिर्जात एंजाइमों का पहला स्रोत हैं, इसलिए दस्ताने बार-बार पहनने और बदलने चाहिए।इसके अलावा मास्क भी पहनना चाहिए, क्योंकि सांस लेना भी एंजाइम्स का एक महत्वपूर्ण स्रोत है।दस्ताने वाला मास्क पहनने का एक अतिरिक्त लाभ प्रयोगकर्ता की सुरक्षा करना है।

2. पिपेट टिप, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, पिपेट - RNase को अकेले नसबंदी द्वारा निष्क्रिय नहीं किया जा सकता है, इसलिए पिपेट टिप्स और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को DEPC से उपचारित किया जाना चाहिए, भले ही उन्हें DEPC उपचारित के रूप में चिह्नित किया गया हो।एक विशेष प्रयोजन पिपेट का उपयोग करना सबसे अच्छा है, उपयोग से पहले इसे 75% अल्कोहल कॉटन बॉल से पोंछ लें, विशेष रूप से रॉड को;इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि हेड रिमूवर का उपयोग न करें।

3. पानी/बफर RNase संदूषण से मुक्त होना चाहिए।

4. कम से कम टेस्ट टेबल को 75% अल्कोहल वाले कॉटन बॉल से साफ करना चाहिए।

5.अंतर्जात RNase सभी ऊतकों में अंतर्जात एंजाइम होते हैं, इसलिए तरल नाइट्रोजन के साथ ऊतकों का त्वरित जमाव गिरावट को कम करने का सबसे अच्छा तरीका है।तरल नाइट्रोजन भंडारण/पीसने की विधि वास्तव में असुविधाजनक है, लेकिन अंतर्जात एंजाइमों के उच्च स्तर वाले ऊतकों के लिए यह एकमात्र तरीका है।

6. आरएनए नमूने आरएनए निष्कर्षण उत्पादों में आरएनएएस संदूषण के निशान हो सकते हैं।

7. प्लास्मिड निष्कर्षण प्लास्मिड निष्कर्षण अक्सर आरएनए को नीचा दिखाने के लिए Rnase का उपयोग करता है, और अवशिष्ट Rnase को प्रोटीनेज़ K के साथ पचाया जाना चाहिए और PCI द्वारा निकाला जाना चाहिए।

8. आरएनए भंडारण यहां तक ​​कि अगर इसे कम तापमान पर संग्रहीत किया जाता है, तो आरएनएएस की थोड़ी सी मात्रा आरएनए क्षरण का कारण बनेगी।आरएनए के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए सबसे अच्छा समाधान नमक/अल्कोहल निलंबन है, क्योंकि अल्कोहल कम तापमान पर सभी एंजाइमेटिक गतिविधि को रोकता है।

9. जब धनायन (Ca, Mg) में ये आयन होते हैं, तो 5 मिनट के लिए 80C पर गर्म करने से RNA विघटित हो जाएगा, इसलिए यदि RNA को गर्म करने की आवश्यकता है, तो संरक्षण समाधान में एक chelating एजेंट (1mM सोडियम साइट्रेट, pH 6.4) होना आवश्यक है।

10. बाद के प्रयोगों में प्रयुक्त एंजाइम RNase द्वारा दूषित हो सकते हैं।

आरएनए निष्कर्षण के लिए 10 युक्तियाँ

1: RNase गतिविधि को तुरंत रोकें।संग्रह के बाद नमूने तुरंत जमा दिए जाते हैं, और विश्लेषण के दौरान तेजी से ऑपरेशन द्वारा RNase को निष्क्रिय कर दिया जाता है।

2: उच्च राइबोजाइम सामग्री वाले ऊतक के लिए एक उपयुक्त निष्कर्षण विधि चुनें, और वसा ऊतक के लिए फिनोल युक्त विधि का उपयोग करना सबसे अच्छा है।

3: पूर्वानुमान गुणवत्ता के लिए उत्तरी की आवश्यकता होती है, सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण के लिए उच्च अखंडता की आवश्यकता होती है, और आरटी-पीसीआर और आरपीए (राइबोन्यूक्लिज़ सुरक्षा परख) के लिए उच्च अखंडता की आवश्यकता नहीं होती है।आरटी-पीसीआर को उच्च शुद्धता (एंजाइम अवरोधक अवशेष) की आवश्यकता होती है।

4: संपूर्ण समरूपीकरण उपज में सुधार और गिरावट को कम करने की कुंजी है।

5: आरएनए वैद्युतकणसंचलन पहचान की अखंडता की जांच करें, 28एस: 18एस = 2:1 एक पूर्ण संकेत है, 1:1 अधिकांश प्रयोगों के लिए भी स्वीकार्य है।

6: आरटी-पीसीआर, सरणी विश्लेषण के लिए डीएनए को हटाना डीएनए को हटाने के लिए Dnase I का उपयोग करना सबसे अच्छा है।

7: बहिर्जात एंजाइमों के प्रदूषण को कम करें - एंजाइमों को बाहर से आयात नहीं किया जा सकता है।

8: कम सांद्रता वाले न्यूक्लिक एसिड को सांद्रित करते समय, एक सह-वर्षा अभिकर्मक जोड़ा जाना चाहिए।लेकिन सह-प्रक्षेपक युक्त एंजाइमों और डीएनए संदूषण को रोकने के लिए।

9: आरएनए को अच्छी तरह से घोलें, यदि आवश्यक हो, तो 5 मिनट के लिए 65C पर गर्म करें।

उपयुक्त भंडारण विधि

इसे थोड़े समय के लिए -20C पर और -80C पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।आरएनए पैदावार में सुधार करने के लिए पहला कदम यह महसूस करना है कि विभिन्न नमूनों की आरएनए सामग्री बहुत भिन्न होती है।उच्च बहुतायत (2-4ug/मिलीग्राम) जैसे कि यकृत, अग्न्याशय, हृदय, मध्यम प्रचुरता (0.05-2ug/मिलीग्राम) जैसे मस्तिष्क, भ्रूण, गुर्दे, फेफड़े, थाइमस, अंडाशय, कम प्रचुरता (<0.05ug/मिलीग्राम) मिलीग्राम) जैसे मूत्राशय, हड्डी, वसा।

1: लाइसे कोशिकाएं आरएन जारी करती हैं - यदि आरएनए जारी नहीं होता है, तो उपज कम हो जाएगी।इलेक्ट्रिक होमोजेनाइजेशन अन्य होमोजेनाइजेशन विधियों की तुलना में बेहतर काम करता है, लेकिन इसे अन्य तरीकों के साथ जोड़ने की भी आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि तरल नाइट्रोजन मैशिंग, एंजाइमैटिक पाचन (लाइसोजाइम/लिटिकेज़)

2: निष्कर्षण विधि का अनुकूलन.फिनोल-आधारित विधियों के साथ सबसे बड़ी समस्याएं अपूर्ण स्तरीकरण और आंशिक आरएनए हानि (सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता) हैं।अपूर्ण स्तरीकरण उच्च न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन सामग्री के कारण होता है, जिसे उपयोग की जाने वाली लाइसेट की मात्रा को बढ़ाकर या नमूने की मात्रा को कम करके हल किया जा सकता है।क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का एक चरण वसा ऊतक में जोड़ा गया था।आरएनए हानि को बैक-पंपिंग द्वारा या सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कार्बनिक परत को हटाकर कम किया जा सकता है।कॉलम सेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियों के साथ सबसे बड़ी समस्या अतिरिक्त नमूना है।

क्लासिक निष्कर्षण युक्तियाँ

1. फिनोल शुद्धि: 1:1 फिनोल/क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा डालें और 1-2 मिनट तक जोर से मिलाएं।2 मिनट के लिए उच्च गति पर अपकेंद्रित्र।सतह पर तैरनेवाला (80-90%) सावधानीपूर्वक हटा दें।मध्य परत तक कभी न पहुंचें.प्रतिक्रिया समाधान की एक समान मात्रा को फिनोल/क्लोरोफॉर्म में जोड़ा जा सकता है और सतह पर तैरनेवाला हटाया जा सकता है।उपज में सुधार के लिए न्यूक्लिक एसिड वर्षा के लिए दो सतह पर तैरनेवाला को एक साथ मिलाया जा सकता है।मिश्रण करते समय बहुत अधिक नरमी न बरतें, और सभी सतह पर तैरने वाले पदार्थों को हटाने का प्रयास न करें।

2. 70-80% इथेनॉल से धोना: धोने के दौरान, न्यूक्लिक एसिड को निलंबित कर दिया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बचा हुआ नमक धुल जाए।उसी समय, इथेनॉल डालने के तुरंत बाद, कुछ सेकंड के लिए उच्च गति पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर एक पिपेट के साथ अवशिष्ट इथेनॉल हटा दें।5-10 मिनट तक कमरे के तापमान पर रखने के बाद घोलें।

11. विशेष संगठनों का निष्कासन

1. रेशेदार ऊतक: हृदय/कंकाल की मांसपेशी जैसे रेशेदार ऊतक से आरएनए निष्कर्षण की कुंजी ऊतक को पूरी तरह से बाधित करना है।इन ऊतकों में कोशिका घनत्व कम होता है, इसलिए ऊतक के प्रति इकाई वजन में आरएनए की मात्रा कम होती है, और जितना संभव हो उतनी शुरुआती मात्रा का उपयोग करना सबसे अच्छा है।ठंड की स्थिति में ऊतक को अच्छी तरह से पीसना सुनिश्चित करें।

2. उच्च प्रोटीन/वसा सामग्री वाले ऊतक: मस्तिष्क/वनस्पति वसा सामग्री उच्च है।पीसीआई निष्कर्षण के बाद, सतह पर तैरनेवाला में सफेद फ्लोक्यूल्स होते हैं।सतह पर तैरनेवाला को क्लोरोफॉर्म के साथ फिर से निकाला जाना चाहिए।

3. उच्च न्यूक्लिक एसिड/राइबोजाइम सामग्री वाले ऊतक: प्लीहा/थाइमस में उच्च न्यूक्लिक एसिड और राइबोजाइम सामग्री होती है।ठंड की स्थिति में ऊतक को पीसने के बाद तेजी से समरूपीकरण करने से राइबोजाइम को प्रभावी ढंग से निष्क्रिय किया जा सकता है।हालाँकि, यदि लाइसेट बहुत चिपचिपा है (उच्च न्यूक्लिक एसिड सामग्री के कारण), तो पीसीआई निष्कर्षण प्रभावी ढंग से स्तरीकृत नहीं हो पाएगा;अधिक लाइसेट जोड़ने से यह समस्या हल हो सकती है।एकाधिक पीसीआई निष्कर्षण अधिक अवशिष्ट डीएनए को हटा सकते हैं।यदि अल्कोहल मिलाने के तुरंत बाद एक सफेद अवक्षेप बनता है, तो यह डीएनए संदूषण का संकेत देता है।विघटन के बाद अम्लीय पीसीआई के साथ पुनः निष्कर्षण डीएनए संदूषण को दूर कर सकता है।

4. पादप ऊतक: पादप ऊतक पशु ऊतक की तुलना में अधिक जटिल होता है।आम तौर पर, पौधों को तरल नाइट्रोजन स्थितियों के तहत जमीन पर रखा जाता है, इसलिए अंतर्जात एंजाइमों द्वारा आरएनए का क्षरण असामान्य है।यदि गिरावट की समस्या का समाधान नहीं होता है, तो यह लगभग निश्चित रूप से नमूने में मौजूद अशुद्धियों के कारण होता है।कई पौधों में मौजूद अशुद्धियाँ अवशेषों का कारण बनेंगी, और अवशेषों का कारण अक्सर यह होता है कि इन अशुद्धियों में आरएनए के साथ कुछ समानताएँ होती हैं: आप अवक्षेपित करते हैं और मैं अवक्षेपित करता हूँ, और आप अवक्षेपित करते हैं और मैं अवक्षेपित करता हूँ।ये विशेषताएँ निर्धारित करती हैं कि वे बहुत मजबूत एंजाइम अवरोधक हैं।

वर्तमान में, वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों को छोटे समायोजन के साथ लगभग सभी जानवरों के ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन कुछ वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक हैं जो अधिकांश पौधों के ऊतकों के लिए उपयुक्त हो सकते हैं।सौभाग्य से, Foregene विशेष प्रदान कर सकता हैप्लांट आरएनए निष्कर्षण किट, अपने पासप्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट, प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस.उत्तरार्द्ध विशेष रूप से उच्च पॉलीसेकेराइड और पॉलीफेनोल सामग्री वाले पौधों के लिए डिज़ाइन किया गया है।आरएनए निष्कर्षण के लिए, प्रयोगशाला उपयोगकर्ताओं से प्रतिक्रिया विशेष रूप से अच्छी है।

12. नमूना जमने और पिघलने का प्रभाव जमे हुए नमूना बड़ा हो सकता है, और आरएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग करने से पहले इसे काटने की आवश्यकता होती है।काटने के दौरान नमूने पिघल जाते हैं (संभवतः आंशिक रूप से)।जमे हुए नमूनों को आरएनए निष्कर्षण से पहले तौलने की आवश्यकता हो सकती है, और इस प्रक्रिया के दौरान पिघलना निश्चित रूप से होगा।कभी-कभी, तरल नाइट्रोजन मिलिंग प्रक्रिया के दौरान नमूने का पिघलना भी होता है;या जमे हुए नमूने को सीधे तरल नाइट्रोजन मिलिंग के बिना लाइसेट में जोड़ा जाता है, और पूर्ण समरूपीकरण से पहले पिघलना निश्चित रूप से होगा।प्रयोगों से पता चला है कि जमे हुए ऊतक में ताजे ऊतक की तुलना में पिघलने के दौरान आरएनए क्षरण की संभावना अधिक होती है।संभावित कारण: फ़्रीज़-पिघलना प्रक्रिया कोशिका के भीतर संरचनाओं को बाधित करती है, जिससे अंतर्जात एंजाइमों के लिए आरएनए के सीधे संपर्क में आना आसान हो जाता है।

13. आरएनए गुणवत्ता का निर्णय आमतौर पर, आरएनए की अखंडता का आकलन करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया जाता है, और आरएनए की शुद्धता का आकलन करने के लिए ए260/ए280 का उपयोग किया जाता है।सिद्धांत रूप में, अक्षुण्ण आरएनए का अनुपात 28S:18S = 2.7:1 है, और अधिकांश डेटा 28S:18S = 2:1 के अनुपात पर जोर देते हैं।तथ्य यह है कि कोशिकाओं के अलावा अन्य नमूनों से निकाले गए लगभग कोई भी आरएनए 2:1 अनुपात में नहीं है (यह एगिलेंट बायोएनालाइज़र का उपयोग करके प्राप्त किया गया था)।

आरएनए के वैद्युतकणसंचलन परिणाम कई कारकों से प्रभावित होते हैं, जिनमें माध्यमिक संरचना, वैद्युतकणसंचलन की स्थिति, नमूना भार, ईबी द्वारा संतृप्ति की डिग्री आदि शामिल हैं। आरएनए का पता लगाने के लिए देशी वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करें और नियंत्रण के रूप में डीएनए मार्कर का उपयोग करें।यदि 2केबी पर 28एस और 0.9केबी पर 18एस स्पष्ट हैं, और 28एस: 18एस > 1, अखंडता अधिकांश बाद के प्रयोगों की आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है।

A260/A280 एक संकेतक है जिसने बहुत भ्रम पैदा किया है।सबसे पहले, न्यूक्लिक एसिड के लिए इस सूचक के मूल अर्थ को स्पष्ट करना आवश्यक है: शुद्ध आरएनए, इसका ए260/280 = लगभग 2.0।शुद्ध आरएनए 'कारण' है और A260/A280 = 2 'प्रभाव' है।अब हर कोई A260/A280 को 'कारण' के रूप में उपयोग कर रहा है, यह सोचकर कि "यदि A260/A280 = 2, तो RNA शुद्ध है", जिससे स्वाभाविक रूप से भ्रम पैदा होता है।

यदि आप रुचि रखते हैं, तो आप अपने आरएनए नमूने में थोड़ा सा अभिकर्मक जोड़ सकते हैं जो अक्सर निष्कर्षण में उपयोग किया जाता है, जैसे कि फिनोल, गुआनिडीन आइसोथियोसाइनेट, पीईजी, आदि, और फिर A260/A280 अनुपात को माप सकते हैं।वास्तविकता यह है कि आरएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले कई अभिकर्मक, साथ ही नमूने में कई अशुद्धियाँ, A260 और A280 के आसपास अवशोषित होती हैं, जिससे A260/A280 प्रभावित होता है।

वर्तमान में सबसे शिक्षाप्रद तरीका 200-300 एनएम रेंज में आरएनए नमूनों को स्कैन करना है।शुद्ध आरएनए के वक्र में निम्नलिखित विशेषताएं हैं: वक्र चिकना है, A230 और A260 दो विभक्ति बिंदु हैं, A300 0 के करीब है, A260/A280 = लगभग 2.0, और A260/A230 = लगभग 2.0 है।यदि स्कैन डेटा उपलब्ध नहीं है, तो A260/A230 अनुपात भी निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि यह अनुपात एंजाइमी प्रतिक्रिया को प्रभावित करने वाली सभी अशुद्धियों को ले जाने के प्रति अधिक संवेदनशील है।डिवाइस की रैखिक सीमा (A260 के लिए 0.1–0.5) को ध्यान में रखें।

दो अन्य उपयोगी घटनाएं हैं: जब A260/A280 को पानी में मापा जाता है तो अनुपात लगभग 0.3 कम होगा;जबकि 10 mM EDTA में मापा गया अनुपात 1 mM EDTA में मापे गए अनुपात से लगभग 0.2 अधिक है।

संबंधित उत्पाद:

चीन प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट निर्माता और आपूर्तिकर्ता |फोरजीन (foreivd.com)

आरएनए अलगाव श्रृंखला आपूर्तिकर्ता और फैक्टरी |चीन आरएनए अलगाव श्रृंखला निर्माता (foreivd.com)

आरएनए अलगाव श्रृंखला - फोरजीन कंपनी लिमिटेड (foreivd.com)