1. आरएनए समाधान के अवशोषण का पता लगाएं
280, 320, 230, और 260 एनएम पर अवशोषण क्रमशः न्यूक्लिक एसिड, पृष्ठभूमि (समाधान मैलापन), नमक एकाग्रता और प्रोटीन जैसे कार्बनिक पदार्थ के मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है।आम तौर पर केवल OD260/OD280 (अनुपात, R) देखें।जब 1.8~2.0, हम सोचते हैं कि आरएनए में प्रोटीन या अन्य कार्बनिक पदार्थ के संदूषण को सहन किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब ट्रिस को अवशोषण का पता लगाने के लिए बफर के रूप में उपयोग किया जाता है, तो आर मान 2 से अधिक हो सकता है (आम तौर पर यह <2.2 होना चाहिए)।जब आर<1.8, समाधान में प्रोटीन या अन्य कार्बनिक पदार्थों का प्रदूषण अधिक स्पष्ट होता है, और आरएनए का भाग्य जरूरतों के अनुसार निर्धारित किया जा सकता है।जब R>2.2, इसका मतलब है कि आरएनए को एकल न्यूक्लिक एसिड में हाइड्रोलाइज किया गया है।
2. आरएनए का इलेक्ट्रोफोरेटिक पैटर्न
आम तौर पर, डीनेचरिंग जेल का उपयोग आरएनए वैद्युतकणसंचलन के लिए किया जाता है, लेकिन यदि यह केवल आरएनए की गुणवत्ता का पता लगाने के लिए है, तो डीनेचरिंग जेल आवश्यक नहीं है, और साधारण एगरोज़ जेल का उपयोग किया जा सकता है।वैद्युतकणसंचलन का उद्देश्य 28S और 18S बैंड की अखंडता और उनके अनुपात, या mRNA स्मीयर की अखंडता का पता लगाना है।आम तौर पर, यदि 28S और 18S बैंड उज्ज्वल, स्पष्ट और तेज हैं (बैंड के किनारों का संदर्भ स्पष्ट है), और 28S की चमक 18S बैंड की तुलना में दोगुनी से अधिक है, तो हम आरएनए की गुणवत्ता को अच्छा मानते हैं।
उपरोक्त दो विधियाँ हैं जिनका हम आमतौर पर उपयोग करते हैं, लेकिन इन दोनों विधियों में से कोई भी हमें स्पष्ट रूप से नहीं बता सकती है कि आरएनए समाधान में अवशिष्ट RNase है या नहीं।यदि समाधान में RNase की बहुत कम मात्रा है, तो उपरोक्त विधि से इसका पता लगाना हमारे लिए मुश्किल है, लेकिन बाद की अधिकांश एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाएं 37 डिग्री से ऊपर और लंबे समय तक की जाती हैं।इस प्रकार, यदि RNA समाधान में RNase की बहुत कम मात्रा है, तो बाद के प्रयोगों में उनकी भूमिका निभाने के लिए एक बहुत ही उपयुक्त वातावरण और समय होगा, और निश्चित रूप से इस समय प्रयोग ठंडा होगा।नीचे हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो पुष्टि कर सकती है कि आरएनए समाधान में अवशिष्ट आरएनएएस है या नहीं।
3. ताप संरक्षण परीक्षण
नमूना एकाग्रता के अनुसार, आरएनए समाधान से दो 1000 एनजी आरएनए निकालें और इसे 0.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, और इसे पीएच 7.0 ट्रिस बफर के साथ 10 उल की कुल मात्रा में पूरक करें, और फिर ट्यूब की टोपी को सील करें।उनमें से एक को 70°C पर स्थिर तापमान वाले पानी के स्नान में रखें और 1 घंटे तक गर्म रखें।दूसरे भाग को 1 घंटे के लिए -20°C रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया गया था।जब समय समाप्त हो जाए, तो वैद्युतकणसंचलन के लिए दो नमूने हटा दें।वैद्युतकणसंचलन पूरा होने के बाद, दोनों के वैद्युतकणसंचलन बैंड की तुलना करें।यदि दोनों के बैंड सुसंगत हैं या उनमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है (बेशक, उनके बैंड भी विधि 2 की शर्तों को पूरा करते हैं), तो इसका मतलब है कि आरएनए समाधान में कोई अवशिष्ट आरएनएएस संदूषण नहीं है, और आरएनए की गुणवत्ता बहुत अच्छी है।इसके विपरीत, यदि 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया नमूना स्पष्ट गिरावट दिखाता है, तो यह इंगित करता है कि आरएनए समाधान में आरएनएएस संदूषण है।
आरएनए निष्कर्षण के लिए 2 प्रायोगिक तरीके और तकनीकें
आरएनए निकालते समय हमें अक्सर जिन समस्याओं का सामना करना पड़ता है वे हैं: (1) आरएनए उपज कम है;(2) आरएनए में गंभीर नमक प्रदूषण है;(3) आरएनए में गंभीर कार्बनिक विलायक प्रदूषण है;(4) नमूना गिरावट और अन्य समस्याएं
1. आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कुल आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक
जानवरों के ऊतकों और जानवरों की कोशिकाओं से कुल आरएनए के निष्कर्षण के लिए गुआनिडाइन आइसोथियोसाइनेट विधि और ट्राइज़ोल विधि सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधियाँ हैं।यह विशेष रूप से छोटे नमूनों और ऊतकों के लिए उपयुक्त है जिन्हें निकालना विशेष रूप से कठिन होता है, जैसे खरगोश की त्वचा और जानवरों के संयोजी ऊतक से कुल आरएनए का निष्कर्षण;इसके अलावा, ट्राइज़ोल, एक सामान्य प्रयोजन लिसीस अभिकर्मक के रूप में, पौधों के ऊतकों, बैक्टीरिया, कवक और अन्य ऊतकों के निष्कर्षण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।पॉलीसेकेराइड और पॉलीफेनॉल युक्त पौधों के ऊतकों, जैसे कि कैमेलिया ओलीफेरा, चाय की पत्तियां, रेपसीड, आदि के लिए, कुल आरएनए निकालने के लिए सीटीएबी विधि का भी उपयोग किया जा सकता है।
एक पारंपरिक विधि के रूप में, डबल-कॉलम विधि भी अपने सामान्य तापमान संचालन, RNase जोड़ने की आवश्यकता नहीं होने और सुरक्षा-निष्कर्षण के लिए क्लोरोफॉर्म, फिनोल और अन्य कार्बनिक अभिकर्मकों के कारण बहुत लोकप्रिय है।(सिफ़ारिश किये हुए उत्पाद )
2. जानवरों के ऊतकों से कुल आरएनए का निष्कर्षण
(1) ताजा ऊतक चुनने का प्रयास करें, यदि यह ताजा नहीं है (अधिमानतः तीन महीने के भीतर - 80 ℃ रेफ्रिजरेटर या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए। ऊतक काटते समय, सीधे कमरे के तापमान पर न काटें, इसे बर्फ के डिब्बे पर रखना सुनिश्चित करें, बार-बार जमने और पिघलने से बचने की कोशिश करें।
(2) ऊतक के एक छोटे टुकड़े को काटने के लिए साफ कैंची और चिमटी का उपयोग करें, नमूना काटते समय ऊतक के मध्य भाग को काटने का प्रयास करें, या पहले ऊतक के बड़े टुकड़े को बीच से काटें, और फिर नमूने को ताजा चीरा स्थान पर काटें।हटाए गए ऊतक को पूरी तरह से टुकड़े-टुकड़े कर दिया जाना चाहिए, कटे हुए ऊतक को बिना आरएनएएस के ईपी ट्यूब में डालें, लाइसेट जोड़ें, कटे हुए ऊतक को पूरी तरह से लाइसेट के संपर्क में लाया जाना चाहिए, और समरूपीकरण के लिए तैयार किया जाना चाहिए।
(3) सामान्य ऊतकों के लिए, समरूपीकरण के लिए मूंग के आकार के ऊतकों (30-60 मिलीग्राम) का चयन करें।यदि ऊतकों में बड़ी मात्रा में प्रोटीन, वसा, या यकृत जैसे घने रेशेदार ऊतक होते हैं, तो कटे हुए ऊतकों की मात्रा को उचित रूप से बढ़ाएं या घटाएं (वैकल्पिक) 10 ~ 20 मिलीग्राम चुनें)।
(4) यदि मछली की मांसपेशी, झींगा मांस, जेलीफ़िश और उच्च जल सामग्री वाले अन्य ऊतक निकाले जाते हैं, तो नमूना मात्रा उचित रूप से बढ़ाई जानी चाहिए (अनुशंसित 100-200 मिलीग्राम)।
(5) यदि स्थितियाँ अनुमति देती हैं, तो पशु ऊतक को उच्च-मार्ग ऊतक होमोजेनाइज़र के साथ समरूप बनाने के बाद सीधे निकाला जा सकता है, यदि ऐसा कोई उपकरण नहीं है।
(6) अंतिम निष्कर्षण के बाद प्राप्त आरएनए को आरएनए के क्षरण को कम करने के लिए तुरंत आइस बॉक्स पर रखा जाना चाहिए।
3. पशु कोशिका आरएनए निष्कर्षण
(1) सस्पेंशन कोशिकाएं: सीधे अपकेंद्रित्र करें और माध्यम को त्यागें, 1-2 बार बाँझ पीबीएस से धोएं, फिर उचित मात्रा में पीबीएस के साथ निलंबित करें, और फिर लसीका के लिए लाइसेट जोड़ें।तरल को पूरी तरह से त्यागने के बाद लाइसेट को सीधे अवक्षेपित कोशिकाओं में न डालें।इससे बाहरी परत पर लाइस्ड कोशिकाओं के बाद निकलने वाला हिस्टोन पैकेज अवक्षेपित कोशिकाओं के बाहर चिपकने का कारण बनेगा, जिससे लिसेट के साथ गोली के अंदर की कोशिकाओं का संपर्क सीमित हो जाएगा।, जिसके परिणामस्वरूप अपूर्ण कोशिका लसीका होता है और आरएनए उपज कम हो जाती है।
(2) कोशिकाएं जो अर्ध-चिपकती हैं या कसकर चिपकती नहीं हैं: माध्यम को त्यागने के बाद, 1-2 बार पीबीएस से धोएं, फिर सीधे पीबीएस की उचित मात्रा को अवशोषित करें और कोशिकाओं को उड़ाने के लिए पिपेट या बंदूक के साथ कल्चर डिश को उड़ा दें, और उन्हें आरएनए-मुक्त कोशिकाओं में स्थानांतरित करें।निष्कर्षण के लिए एंजाइम की ईपी ट्यूब में लाइसेट जोड़ें।
(3) अनुवर्ती कोशिकाओं को पहले ट्रिप्सिन के साथ पचाने की आवश्यकता होती है, फिर आरएनएएस-मुक्त ईपी ट्यूबों में एकत्र किया जाता है, सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, अतिरिक्त ट्रिप्सिन को हटाने के लिए पीबीएस के साथ 1-2 बार धोया जाता है, और पीबीएस की उचित मात्रा के साथ फिर से निलंबित किया जाता है, फिर निष्कर्षण चरण पर आगे बढ़ें।
4. पादप आरएनए निष्कर्षण
पौधों के ऊतक फेनोलिक यौगिकों से भरपूर होते हैं, या पॉलीसेकेराइड से भरपूर होते हैं, या उनमें कुछ अज्ञात माध्यमिक मेटाबोलाइट्स होते हैं, या उनमें RNase की उच्च गतिविधि होती है।कोशिका विश्लेषण के बाद ये पदार्थ आरएनए के साथ कसकर जुड़ जाते हैं और अघुलनशील कॉम्प्लेक्स या कोलाइडल अवक्षेप बनाते हैं, जिन्हें निकालना मुश्किल होता है।इसलिए, जब हम पौधों के ऊतक निकालते हैं, तो हमें पौधों के लिए एक किट चुनने की आवश्यकता होती है।किट में मौजूद लाइसेट पॉलीफेनॉल के आसान ऑक्सीकरण और पॉलीसेकेराइड यौगिकों और न्यूक्लिक एसिड को अलग करने की समस्याओं को प्रभावी ढंग से हल कर सकता है।
(पॉलीसेकेराइड पॉलीफेनोल संयंत्र आरएनए निष्कर्षण के लिए, अनुशंसित उत्पाद:
(1) पौधे का छिलका, गूदा, बीज, पत्तियाँ आदि पूरी तरह ओखली में पीस लेना चाहिए।पीसने की प्रक्रिया के दौरान, नमूने को पिघलने से बचाने के लिए तरल नाइट्रोजन की समय पर भरपाई की जानी चाहिए।आरएनए क्षरण से बचने के लिए जमीन के नमूने को जल्दी से लाइसेट में जोड़ा जाना चाहिए और हिलाया जाना चाहिए।
(2) चावल और गेहूं की पत्तियों जैसे फाइबर युक्त नमूनों के लिए, निष्कर्षण की मात्रा उचित रूप से कम की जानी चाहिए, अन्यथा ऊतक पीसने और लसीका पूरा नहीं होगा, जिसके परिणामस्वरूप निकाले गए आरएनए की कम उपज होगी।
(3) उच्च जल सामग्री वाले पौधों के ऊतकों, जैसे अनार फल, तरबूज फल, आड़ू फल, आदि के लिए, नमूना आकार उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए (100-200 मिलीग्राम वैकल्पिक है)।
(4) पौधों के ऊतकों, जैसे कि पौधों की पत्तियां, प्रकंद, कठोर फल और अन्य सामग्रियों को आमतौर पर मोर्टार में सामग्री को अच्छी तरह से घोलने के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, और फिर निष्कर्षण चरण पर आगे बढ़ते हैं।पारंपरिक ऊतक होमोजेनाइज़र पौधों के ऊतकों को समरूप बनाने में प्रभावी नहीं हो सकते हैं, और आमतौर पर इनकी अनुशंसा नहीं की जाती है।
5. आरएनए निष्कर्षण के लिए सावधानियां
(1) बार-बार जमने और पिघलने से बचने के लिए ऊतक के नमूने यथासंभव ताज़ा होने चाहिए।
(2) निष्कर्षण के दौरान ऊतक पूरी तरह से पीसा हुआ होना चाहिए, और ऊतक की मात्रा बहुत कम नहीं होनी चाहिए, बहुत अधिक तो छोड़ ही दें।
(3) नमूने को पूरी तरह से लाइज़ करने के लिए लाइसेट जोड़ने के बाद पर्याप्त ऊष्मायन समय दिया जाना चाहिए।
(4) निष्कर्षण के लिए ट्राइज़ोल विधि का उपयोग करते समय, स्तरीकरण के बाद सतह पर तैरनेवाला को अवशोषित करने का सिद्धांत "अधिक साँस लेने की तुलना में कम साँस लेना पसंद करता है", और इसे मध्य परत तक नहीं निकालना चाहिए, अन्यथा यह गंभीर जीनोमिक डीएनए संदूषण का कारण बनेगा।
(5) धोते समय, पूरी तरह से धुलाई सुनिश्चित करने के लिए धोने वाला तरल ट्यूब की दीवार के चारों ओर पूरी तरह से घुस जाना चाहिए।
(6) कॉलम निष्कर्षण विधि के लिए, धोने के बाद कॉलम को अलग करने के अलावा, सोखने वाले कॉलम को भी एक अल्ट्रा-क्लीन बेंच में रखा जाना चाहिए और कार्बनिक विलायक को सूखने के लिए पूरी तरह से वाष्पित करने के लिए 5-10 मिनट के लिए उड़ाया जाना चाहिए।
(7) कॉलम विधि के अंतिम निक्षालन में, डीईपीसी पानी जोड़ने के बाद, इसे 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाना चाहिए, या निक्षालन उपज बढ़ाने के लिए डीईपीसी पानी को पहले से 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए।पारंपरिक ट्राइज़ोल क्लीवेज और आइसोप्रोपेनॉल वर्षा विधि में, अंतिम आरएनए को डीईपीसी पानी में भंग कर दिया जाता है, इसलिए विघटन के लिए उचित समय दिया जाना चाहिए, और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के निचले हिस्से को पिपेट टिप के साथ लगातार उड़ाया जाना चाहिए।
3 टीकम आरएनए सांद्रण/खराब गुणवत्ता के तीन कारण और समाधान
1. उपज बहुत कम है
निकाला गया नमूना बहुत कम है, कुल मात्रा अपर्याप्त है, या निकाला गया नमूना बहुत अधिक है और विश्लेषण पूरा नहीं हुआ है;निष्कर्षण के लिए उचित गुणवत्ता के ऊतक या कोशिकाओं का उपयोग किया जाना चाहिए, नमूने का पूर्व-उपचार अच्छी तरह से किया जाना चाहिए, और लसीका पर्याप्त होना चाहिए।
2. जीनोम अवशेष
ट्राइज़ोल विधि द्वारा निकालते समय, जब सतह पर तैरनेवाला परत के बाद मध्य परत में चूसा जाता है, तो गंभीर जीनोम संदूषण हो जाएगा;परत बनाते समय मध्य परत में समा जाने से बचने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतनी चाहिए।यदि निष्कर्षण के लिए कॉलम विधि का उपयोग किया जाता है, तो DNase I युक्त एक किट को निष्कर्षण के लिए चुना जा सकता है।झिल्ली पर अधिशोषित न्यूक्लिक एसिड सीधे DNase I के साथ पच जाता है, जो डीएनए अवशेषों को काफी कम कर सकता है।
3. आरएनए क्षरण
यह स्वयं निकाले गए नमूने का क्षरण हो सकता है, या निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान होने वाला क्षरण हो सकता है;जहां तक संभव हो, आरएनए निष्कर्षण के लिए ताजा नमूनों का उपयोग किया जाना चाहिए, और एकत्र किए गए नमूनों को समय पर तरल नाइट्रोजन या -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहित किया जाना चाहिए, और बार-बार जमने और पिघलने से बचना चाहिए।आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया में RNase/DNase मुक्त टिप्स, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और अन्य सामग्रियों का उपयोग किया जाना चाहिए।निष्कर्षण प्रक्रिया यथासंभव तेज होनी चाहिए।निकाले गए आरएनए को एक आइस बॉक्स पर रखा जाना चाहिए और -80 समय पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।यदि निकाले गए आरएनए को जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पता लगाने की आवश्यकता है, तो निष्कर्षण के तुरंत बाद वैद्युतकणसंचलन किया जाना चाहिए, और वैद्युतकणसंचलन बफर को एक नए तैयार किए गए से बदला जाना चाहिए।
4. नमक और कार्बनिक विलायक अवशेष
निष्कर्षण अभिकर्मकों में फिनोल और गुआनिडीन लवण होते हैं, और धोने के घोल में इथेनॉल होता है।निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, लाइसेट को पूरी तरह से अवशोषित और त्याग नहीं किया गया था, और धोने का समाधान पूरी तरह से सूख नहीं गया था।अवशिष्ट लवण और कार्बनिक सॉल्वैंट्स बाद के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर के लिए हानिकारक हैं।निषेध की विभिन्न डिग्री, इसलिए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान ऊतक लाइसेट को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए, और धुलाई पर्याप्त होनी चाहिए ताकि ट्यूब की आसपास की दीवारों को धोया जा सके।इसके अलावा, ट्यूब को खाली करना और फुलाना एक आवश्यक कदम है, जो कार्बनिक पदार्थ के अवशेषों को और कम कर देगा।
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पोस्ट करने का समय: दिसंबर-01-2022
