1. प्रारंभिक समझ

इस स्तर पर, हमें कुछ अवधारणाओं और शब्दावली को समझने की आवश्यकता है, ताकि अपने वरिष्ठों के सामने गलतियाँ करने से बचें, जैसे:

प्रश्न: आरटी-पीसीआर, क्यूपीसीआर, रीयल-टाइम पीसीआर और रीयल-टाइम आरटी-पीसीआर के बीच क्या अंतर है?

उत्तर: आरटी-पीसीआर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर है(रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, आरटी-पीसीआर), जो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला प्रकार है।आरटी-पीसीआर में, एक आरएनए स्ट्रैंड को पूरक डीएनए में उल्टा स्थानांतरित किया जाता है, जिसे फिर पीसीआर द्वारा डीएनए प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है।
वास्तविक समय-पीसीआर और क्यूपीसीआर(मात्रात्मक रीयलटाइम-पीसीआर) एक ही बात है, दोनों वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर हैं, जिसका अर्थ है कि पीसीआर के प्रत्येक चक्र में वास्तविक समय डेटा रिकॉर्ड होते हैं, इसलिए प्रारंभिक टेम्पलेट्स की संख्या को सटीक विश्लेषण समायोजित किया जा सकता है।

यद्यपि वास्तविक समय पीसीआर (वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर) और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर) दोनों को आरटी-पीसीआर के रूप में संक्षिप्त किया गया प्रतीत होता है, अंतरराष्ट्रीय सम्मेलन यह है: आरटी-पीसीआर विशेष रूप से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को संदर्भित करता हैपीसीआर, वास्तविक समय पीसीआर को आमतौर पर क्यूपीसीआर (मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर) के रूप में संक्षिप्त किया जाता है।.

और वास्तविक समय आरटी-पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर), यह फ्लोरोसेंट मात्रात्मक तकनीक के साथ संयुक्त रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर है: पहले आरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से सीडीएनए (आरटी) प्राप्त करें, और फिर मात्रात्मक विश्लेषण (क्यूपीसीआर) के लिए वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करें।अधिकांश प्रयोगशालाएं आरटी-क्यूपीसीआर करती हैं, यानी आरएनए अभिव्यक्ति डाउन-रेगुलेशन पर शोध करती हैं, इसलिए प्रयोगशाला में हर कोई जिस क्यूपीसीआर के बारे में बात करता है वह वास्तव में आरटी-क्यूपीसीआर को संदर्भित करता है, लेकिन यह मत भूलिए कि नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों में अभी भी कई डीएनए परीक्षण हैं।मात्रात्मक विश्लेषण, जैसे हेपेटाइटिस बी वायरस एचबीवी का पता लगाना।

प्रश्न: बहुत सारे फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर को पढ़ने के बाद, प्रवर्धित टुकड़े को 80-300बीपी की सीमा के भीतर नियंत्रित क्यों किया जाना चाहिए?

उत्तर: प्रत्येक जीन अनुक्रम की लंबाई अलग-अलग होती है, कुछ कई केबी की होती हैं, कुछ सैकड़ों बीपी की होती हैं, लेकिन प्राइमर डिजाइन करते समय हमें केवल उत्पाद की लंबाई 80-300 बीपी की आवश्यकता होती है, बहुत छोटा या बहुत लंबा फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर पहचान के लिए उपयुक्त नहीं है।उत्पाद का टुकड़ा इतना छोटा है कि उसे प्राइमर-डिमर से अलग नहीं किया जा सकता।प्राइमर-डिमर की लंबाई लगभग 30-40बीपी है, और यदि यह 80बीपी से कम है तो यह अंतर करना मुश्किल है कि यह प्राइमर-डिमर है या उत्पाद।यदि उत्पाद का टुकड़ा बहुत लंबा है, 300बीपी से अधिक है, तो यह आसानी से कम प्रवर्धन दक्षता को जन्म देगा और जीन की मात्रा का प्रभावी ढंग से पता नहीं लगा सकेगा।

उदाहरण के लिए, जब आप गिनते हैं कि कक्षा में कितने लोग हैं, तो आपको केवल यह गिनना है कि वहाँ कितने मुँह हैं।जब आप जीन का पता लगाते हैं तो यही बात सच होती है, आपको केवल जीन के एक निश्चित अनुक्रम का पता लगाने की आवश्यकता होती है ताकि संपूर्ण अनुक्रम प्रदर्शित हो सके।यदि आप लोगों की गिनती करना चाहते हैं, तो आपको मुंह और नाक, कान और चश्मे दोनों को गिनना होगा, और गलतियाँ करना आसान है।

विस्तार करने के लिए, जैविक अनुसंधान में, बिंदु से क्षेत्र तक कई शोध मामले हैं, क्योंकि किसी भी प्रजाति का जीन अनुक्रम बहुत लंबा है, सभी टुकड़ों को मापना अनावश्यक और असंभव है, जैसे कि बैक्टीरिया 16 एस अनुक्रमण, जो बैक्टीरिया के रूढ़िवादी अनुक्रम को पूरा करने के लिए बैक्टीरिया की एक निश्चित आबादी की संख्या का अनुमान लगाने के लिए है।

प्रश्न: क्यूपीसीआर प्राइमर डिज़ाइन के लिए इष्टतम लंबाई क्या है?

उत्तर: सामान्यतया, प्राइमर की लंबाई लगभग 20-24bp होती है, जो बेहतर है।बेशक, हमें प्राइमर डिजाइन करते समय प्राइमर के टीएम मूल्य पर ध्यान देना चाहिए, क्योंकि यह इष्टतम एनीलिंग तापमान से संबंधित है।बहुत सारे प्रयोगों के बाद यह सिद्ध हो चुका है कि 60°C एक बेहतर TM मान है।यदि एनीलिंग तापमान बहुत कम है, तो यह आसानी से गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को जन्म देगा।यदि एनीलिंग तापमान बहुत अधिक है, तो प्रवर्धन दक्षता अपेक्षाकृत कम होगी, प्रवर्धन वक्र का शिखर बाद में शुरू होगा, और सीटी मान में देरी होगी।

प्रश्न: डाई विधि जांच विधि से किस प्रकार भिन्न है?

उत्तर: रंगाई विधिकुछ फ्लोरोसेंट रंग, जैसे कि एसवाईबीआर ग्रीन Ⅰ, पिकोग्रीन, बीईबीओ इत्यादि, स्वयं प्रकाश उत्सर्जित नहीं करते हैं, लेकिन डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के छोटे खांचे से जुड़ने के बाद फ्लोरोसेंस उत्सर्जित करेंगे।इसलिए, पीसीआर प्रतिक्रिया की शुरुआत में, मशीन फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता नहीं लगा सकती है।जब प्रतिक्रिया एनीलिंग-विस्तार चरण तक पहुंचती है, तो डबल स्ट्रैंड खुल जाता है, और डीएनए पोलीमरेज़ की कार्रवाई के तहत एक नया स्ट्रैंड संश्लेषित होता है, और फ्लोरोसेंट अणु डीएसडीएनए माइनर ग्रूव से जुड़ जाता है।जैसे-जैसे पीसीआर चक्रों की संख्या बढ़ती है, अधिक से अधिक रंगों को डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के साथ जोड़ा जाता है, और फ्लोरोसेंट सिग्नल भी लगातार बढ़ाया जाता है।डाई विधि का उपयोग मुख्य रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान में किया जाता है।
पुनश्च: प्रयोग करते समय सावधान रहें, डाई को मानव डीएनए के साथ मिलाना होगा, इसे एक फ्लोरोसेंट व्यक्ति में बदलने के लिए सावधान रहें।

डाई विधि (बाएं) जांच विधि (दाएं)
पुनश्च: प्रयोग करते समय सावधान रहें, डाई को मानव डीएनए के साथ मिलाना होगा, इसे एक फ्लोरोसेंट व्यक्ति में बदलने के लिए सावधान रहें।

SYBR ग्रीन Ⅰ डीएनए के छोटे खांचे से बंधता है

जांच विधिटैक्मैन जांच सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली हाइड्रोलिसिस जांच है।जांच के 5′ सिरे पर एक फ्लोरोसेंट समूह होता है, आमतौर पर एफएएम, और जांच स्वयं लक्ष्य जीन का पूरक अनुक्रम है।3′ सिरे पर एक फ्लोरोसेंट शमन समूह है।प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण, एफआरईटी) के सिद्धांत के अनुसार, जब रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह (दाता फ्लोरोसेंट अणु) और शमन फ्लोरोसेंट समूह (स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट अणु) उत्तेजित होते हैं। जब स्पेक्ट्रा ओवरलैप होता है और दूरी बहुत करीब (7-10 एनएम) होती है, तो दाता अणु की उत्तेजना स्वीकर्ता अणु के प्रतिदीप्ति को प्रेरित कर सकती है, जबकि ऑटोफ्लोरेसेंस कमजोर हो जाता है।इसलिए, पीसीआर प्रतिक्रिया की शुरुआत में, जब जांच सिस्टम में स्वतंत्र और बरकरार है, तो रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह फ्लोरोसेंस उत्सर्जित नहीं करेगा।एनीलिंग करते समय, प्राइमर और प्रोब टेम्पलेट से जुड़ जाते हैं।विस्तार चरण के दौरान, पोलीमरेज़ लगातार नई श्रृंखलाओं का संश्लेषण करता है।डीएनए पोलीमरेज़ में 5′-3′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि होती है।जांच तक पहुंचने पर, डीएनए पोलीमरेज़ टेम्पलेट से जांच को हाइड्रोलाइज करेगा, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट समूह को क्वेंचर फ्लोरोसेंट समूह से अलग करेगा, और फ्लोरोसेंट सिग्नल जारी करेगा।चूंकि जांच और टेम्पलेट के बीच एक-से-एक संबंध है, इसलिए परीक्षण की सटीकता और संवेदनशीलता के मामले में जांच विधि डाई विधि से बेहतर है।जांच विधि का उपयोग मुख्य रूप से निदान में किया जाता है।

प्रश्न: पूर्ण परिमाणीकरण क्या है?सापेक्ष परिमाणीकरण क्या है?

उत्तर: पूर्ण परिमाणीकरण का तात्पर्य qपीसीआर द्वारा परीक्षण किए जाने वाले नमूने की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की गणना से है, जैसे कि 1 मिलीलीटर रक्त में कितने एचबीवी वायरस हैं।सापेक्ष परिमाणीकरण द्वारा प्राप्त परिणाम किसी अन्य संदर्भ नमूने के सापेक्ष एक विशिष्ट नमूने में लक्ष्य जीन की मात्रा में परिवर्तन होता है, और जीन अभिव्यक्ति ऊपर-विनियमित या डाउन-विनियमित होती है।

प्रश्न: क्या आरएनए निष्कर्षण की मात्रा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता और प्रवर्धन दक्षता प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करेगी?
प्रश्न: क्या नमूना भंडारण, निष्कर्षण अभिकर्मक, रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन अभिकर्मक और प्रकाश-संचारण उपभोग्य वस्तुएं प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करेंगी?
प्रश्न: कौन सी विधि प्रायोगिक डेटा को सही कर सकती है?

इन मुद्दों के संबंध में, हम नीचे उन्नत और उन्नत अनुभागों में उनका विस्तार से वर्णन करेंगे।
2. उन्नत ज्ञान

वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर के संबंध में, हमें इस वास्तविकता को पहचानना चाहिए कि हर साल हजारों वैज्ञानिक शोध पत्र प्रकाशित होते हैं, जिनमें फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर तकनीक एक छोटी संख्या नहीं है।

यदि फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर प्रयोग को मापने के लिए कोई सामान्य मानक नहीं है, तो परिणाम व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं।एक ही प्रजाति के एक ही जीन के लिए, एक ही प्रसंस्करण विधि के साथ, पता लगाने के परिणाम भी व्यापक रूप से भिन्न होंगे, और देर से आने वालों के लिए समान परिणामों को दोहराना मुश्किल होगा।आप कोई नहीं जानते कि कौन सा सही है और कौन सा ग़लत है।

क्या इसका मतलब यह है कि फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर एक धोखा तकनीक या अविश्वसनीय तकनीक है?नहीं, ऐसा इसलिए है क्योंकि फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर अधिक संवेदनशील और अधिक सटीक है, और थोड़ा सा गलत ऑपरेशन पूरी तरह से विपरीत परिणाम देगा।एक छोटी सी हानि हजारों मील दूर होती है.लेख के लेखक को समीक्षकों द्वारा बार-बार प्रताड़ित किया जा सकता है।साथ ही, जर्नल के समीक्षकों के लिए भी अलग-अलग प्रयोगात्मक परिणामों में से चयन करना कठिन होता है।

कुल मिलाकर, वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों में आम सहमति की कमी की ओर इशारा किया गया है।इस उद्देश्य से, उद्योग के वरिष्ठ वैज्ञानिकों ने मानक तैयार करना शुरू किया,इन मानकों को पूरा करने के लिए योगदानकर्ताओं को लेख में कुछ आवश्यक प्रयोगात्मक और डेटा प्रोसेसिंग विवरण (आवश्यक डेटा सहित) प्रदान करने की आवश्यकता है।

समीक्षक इन विवरणों को पढ़कर प्रयोग की गुणवत्ता का आकलन कर सकते हैं;भावी पाठक प्रयोग को दोहराने या प्रयोग को बेहतर बनाने के लिए भी इसका उपयोग कर सकते हैं।फिर इस प्रकार प्राप्त प्रयोगात्मक परिणाम जानकारी से परिपूर्ण, उच्च गुणवत्तायुक्त एवं प्रयोगयोग्य होते हैं।

MIBBI (जैविक और बायोमेडिकल जांच के लिए न्यूनतम जानकारी -http://www.mibbi.org) में अंदर आना।MIBBI एक परियोजना है जो प्रयोगों के लिए मानक प्रदान करती है.यह प्रकृति में प्रकाशित है.इस परियोजना का उद्देश्य विभिन्न जैविक प्रयोगों पर है, जिसमें कोशिका जीव विज्ञान, माइक्रोएरे, क्यूपीसीआर जिस पर हम अभी चर्चा करने जा रहे हैं, आदि शामिल हैं, और पांडुलिपियां जमा करते समय प्रत्येक प्रकार के प्रयोग के लिए प्रदान करता है।वह जानकारी हर समय प्रदान की जानी चाहिए.

MIBBI परियोजना में, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर से संबंधित दो लेख हैं:
·आरडीएमएल (रीयल-टाइम पीसीआर डेटा मार्कअप लैंग्वेज) - वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर डेटा के लिए एक संरचित भाषा और रिपोर्टिंग गाइड;
·MIQE (मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों के प्रकाशन के लिए न्यूनतम जानकारी) - वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगों के बारे में लेख प्रकाशित करने के लिए न्यूनतम जानकारी।
सबसे पहले, आइए आरडीएमएल, शब्दावली विनिर्देश के बारे में बात करते हैं।

यदि हर चीज़ के लिए कोई मानक परिभाषा नहीं है, तो चर्चा जारी रखना असंभव है, यही कारण है कि परीक्षा में शब्दों की व्याख्या इतनी महत्वपूर्ण है।
फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर प्रयोग में प्रयुक्त शब्दावली में निम्नलिखित सामग्री शामिल है।QIAGEN ने हमारे लिए सर्वोत्तम सारांश बनाया है।निम्नलिखित सभी सूखे हैंचीज़ें .

प्रवर्धन वक्र
प्रवर्धन वक्र पीसीआर प्रक्रिया के दौरान बने वक्र को संदर्भित करता है, जिसमें चक्र संख्या एब्सिस्सा और प्रतिक्रिया के दौरान वास्तविक समय प्रतिदीप्ति तीव्रता को कोटि के रूप में होती है।

एक उत्कृष्ट प्रवर्धन वक्र में निम्नलिखित विशेषताएं होनी चाहिए: आधार रेखा सपाट है या थोड़ी कम हुई है, और कोई स्पष्ट ऊपर की ओर रुझान नहीं है;वक्र का विभक्ति बिंदु स्पष्ट है, और घातीय चरण का ढलान प्रवर्धन दक्षता के समानुपाती होता है।ढलान जितना अधिक होगा, प्रवर्धन दक्षता उतनी ही अधिक होगी;समग्र प्रवर्धन वक्र समानता अच्छा है, यह दर्शाता है कि प्रत्येक ट्यूब की प्रवर्धन दक्षता समान है;कम-सांद्रता नमूनों के प्रवर्धन वक्र का घातीय चरण स्पष्ट है।

आधार रेखा (बेसलाइन)
आधार रेखा प्रारंभिक चक्र का शोर स्तर है, आमतौर पर तीसरे और 15वें चक्र के बीच मापा जाता है, क्योंकि इस अवधि के दौरान प्रवर्धन उत्पाद के कारण होने वाली प्रतिदीप्ति मूल्य वृद्धि का पता नहीं लगाया जा सकता है।बेसलाइन की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चक्रों की संख्या भिन्न हो सकती है और यदि उच्च टेम्पलेट मात्रा का उपयोग किया जाता है या यदि लक्ष्य जीन का अभिव्यक्ति स्तर अधिक है तो इसे कम करने की आवश्यकता हो सकती है।

बेसलाइन सेट करने के लिए रैखिकता प्रवर्धन वक्र से प्रतिदीप्ति डेटा देखने की आवश्यकता होती है।आधार रेखा निर्धारित की जाती है ताकि प्रवर्धन वक्र की वृद्धि आधार रेखा चक्र शीर्ष संख्या से अधिक चक्र संख्या से शुरू हो।प्रत्येक लक्ष्य अनुक्रम के लिए आधार रेखाएँ व्यक्तिगत रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।प्रारंभिक चक्रों में पाए गए औसत प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्रवर्धित उत्पादों में प्राप्त प्रतिदीप्ति मूल्यों से घटाया जाना चाहिए।विभिन्न रियल-टाइम पीसीआर सॉफ़्टवेयर के नवीनतम संस्करण व्यक्तिगत नमूनों के लिए बेसलाइन सेटिंग्स के स्वचालित अनुकूलन की अनुमति देते हैं।

पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के पहले कुछ चक्रों के दौरान, प्रतिदीप्ति संकेत ज्यादा नहीं बदलता है।एक सीधी रेखा तक पहुँचने को आधार रेखा कहा जाता है, लेकिन अगर हम पहले कुछ चक्रों को करीब से देखें, तो हम देखते हैं कि आधार रेखा के भीतर वही हो रहा है जो नीचे दी गई तस्वीर में हो रहा है।

पृष्ठभूमि पृष्ठभूमि का तात्पर्य है
प्रतिक्रिया में गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति मान।उदाहरण के लिए: अकुशल प्रतिदीप्ति शमन;या SYBR ग्रीन के उपयोग के कारण बड़ी संख्या में डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्पलेट।सिग्नल के पृष्ठभूमि घटकों को रीयल-टाइम पीसीआर सॉफ़्टवेयर एल्गोरिदम द्वारा गणितीय रूप से हटा दिया जाता है।

रिपोर्टर का संकेत
रिपोर्टर सिग्नल वास्तविक समय पीसीआर के दौरान एसवाईबीआर ग्रीन या फ्लोरोसेंटली लेबल अनुक्रम-विशिष्ट जांच द्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेंट सिग्नल को संदर्भित करता है।

सामान्यीकृत रिपोर्टर सिग्नल (आरएन)
आरएन प्रत्येक चक्र में मापी गई निष्क्रिय संदर्भ डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता से विभाजित रिपोर्टर डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता को संदर्भित करता है।

निष्क्रिय संदर्भ डाई
कुछ वास्तविक समय पीसीआर में,फ्लोरोसेंट डाई आरओएक्स का उपयोग फ्लोरोसेंट सिग्नल को सामान्य करने के लिए आंतरिक संदर्भ के रूप में किया जाता है.यह कुएं-दर-कुएं के आधार पर गलत पिपेटिंग, कुएं की स्थिति और प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव के कारण होने वाले बदलावों को ठीक करता है।

प्रतिदीप्ति सीमा (दहलीज)
पृष्ठभूमि मान से ऊपर और प्रवर्धन वक्र के पठारी मान से काफी नीचे समायोजित किया गया था।इसे प्रवर्धन वक्र के रैखिक क्षेत्र में स्थित होना चाहिए, जो पीसीआर पहचान की लॉग-रैखिक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है।थ्रेसहोल्ड को लॉग-एम्प्लीफिकेशन वक्र दृश्य में सेट किया जाना चाहिए ताकि पीसीआर का लॉग-लीनियर चरण आसानी से पहचाना जा सके।यदि रीयल-टाइम पीसीआर में एकाधिक लक्ष्य जीन हैं, तो प्रत्येक लक्ष्य के लिए सीमा निर्धारित की जानी चाहिए।आम तौर पर, पीसीआर प्रतिक्रिया के पहले 15 चक्रों के प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि संकेत के रूप में किया जाता है, और प्रतिदीप्ति सीमा पीसीआर के पहले 3 से 15 चक्रों के प्रतिदीप्ति संकेत के मानक विचलन का 10 गुना है, और प्रतिदीप्ति सीमा पीसीआर प्रवर्धन के घातीय चरण में निर्धारित की जाती है।सामान्य तौर पर, प्रत्येक उपकरण के उपयोग से पहले उसकी प्रतिदीप्ति सीमा निर्धारित होती है।

साइकिल थ्रेसहोल्ड (सीटी) या क्रॉसिंग प्वाइंट (सीपी)
वह चक्र जिस पर प्रवर्धन वक्र दहलीज को पार करता है (यानी, वह बिंदु जिस पर प्रतिदीप्ति पहचान काफी बढ़ जाती है)।सीटी एक अंश हो सकता है और शुरुआती टेम्पलेट की मात्रा की गणना की जा सकती है।सीटी मान अनुभव किए गए चक्रों की संख्या को दर्शाता है जब प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में फ्लोरोसेंट सिग्नल निर्धारित सीमा तक पहुंचता है।प्रत्येक टेम्प्लेट के CT मान और टेम्प्लेट की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक के बीच एक रैखिक संबंध है,प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या जितनी अधिक होगी, सीटी मान उतना ही छोटा होगा, और इसके विपरीत.ज्ञात प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के साथ एक मानक का उपयोग करके एक मानक वक्र बनाया जा सकता है, जिसमें एब्सिस्सा सीटी मान का प्रतिनिधित्व करता है, और कोटि प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक का प्रतिनिधित्व करता है।इसलिए, जब तक अज्ञात नमूने का सीटी मान प्राप्त होता है, तब तक नमूने की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की गणना मानक वक्र से की जा सकती है।

ΔCT मान
ΔCT मान वर्णन करता हैलक्ष्य जीन और संबंधित अंतर्जात संदर्भ जीन सीटी मान के बीच अंतर, जैसे कि हाउसकीपिंग जीन, और उपयोग किए गए टेम्पलेट की मात्रा को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है:
⇒ΔCT = CT (लक्ष्य जीन) - CT (अंतर्जात संदर्भ जीन)

ΔΔCT मान
ΔΔCT मान रुचि के नमूने (उदाहरण के लिए, उत्तेजित कोशिकाएं) के औसत ΔΔCT मान और संदर्भ नमूने (उदाहरण के लिए, उत्तेजित कोशिकाएं) के औसत ΔΔCT मान के बीच अंतर का वर्णन करता है।संदर्भ नमूने को अंशांकन नमूना भी कहा जाता है और सापेक्ष परिमाणीकरण के लिए अन्य सभी नमूनों को इसके लिए सामान्यीकृत किया जाता है:
⇒ΔΔCT = औसत ΔCT (रुचि का नमूना) - औसत ΔCT (संदर्भ नमूना)

अंतर्जात संदर्भ जीन (अंतर्जात संदर्भ जीन)
अंतर्जात संदर्भ जीन, जैसे हाउसकीपिंग जीन (हाउसकीपिंग जीन) के अभिव्यक्ति स्तर, नमूनों के बीच भिन्न नहीं होते हैं।संदर्भ जीन के सीटी मानों की लक्ष्य जीन से तुलना करने से लक्ष्य जीन के अभिव्यक्ति स्तर को इनपुट आरएनए या सीडीएनए की मात्रा के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है (उपरोक्त ΔCT मानों पर अनुभाग देखें)।

आंतरिक संदर्भ जीन के लिए सही हैसंभावित आरएनए क्षरण या आरएनए नमूनों में एंजाइम अवरोधकों की उपस्थिति, साथ ही आरएनए सामग्री, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता, न्यूक्लिक एसिड रिकवरी और नमूना हैंडलिंग में भिन्नता।इष्टतम संदर्भ जीन का चयन करने के लिए, हमने प्रयोगात्मक सेटिंग पर निर्भर इष्टतम संदर्भ के चयन की अनुमति देने के लिए एल्गोरिदम को संशोधित किया।

आंतरिक नियंत्रण
एक नियंत्रण अनुक्रम जिसे लक्ष्य अनुक्रम के समान प्रतिक्रिया में बढ़ाया जाता है और एक अलग जांच (यानी, डुप्लेक्स पीसीआर प्रदर्शन) के साथ जांच की जाती है।आंतरिक नियंत्रणों का उपयोग अक्सर विफल प्रवर्धन को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है, जैसे कि जब लक्ष्य अनुक्रम का पता नहीं चलता है।
अंशांकन नमूना
एक संदर्भ नमूना (उदाहरण के लिए, एक सेल लाइन या ऊतक से शुद्ध आरएनए) का उपयोग जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए अन्य सभी नमूनों की तुलना करने के लिए सापेक्ष मात्रा निर्धारण में किया जाता है।अंशांकन नमूना कोई भी नमूना हो सकता है, लेकिन आमतौर पर एक नियंत्रण होता है (उदाहरण के लिए, एक अनुपचारित नमूना या प्रयोग के समय शून्य से एक नमूना)।

सकारात्मक नियंत्रण
के साथ नियंत्रण प्रतिक्रियाओं का उपयोग करेंटेम्पलेट की ज्ञात मात्रा.सकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग अक्सर यह जांचने के लिए किया जाता है कि प्राइमर सेट या प्राइमर-जांच सेट ठीक से काम कर रहा है और प्रतिक्रिया सही ढंग से सेट की गई है।

कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं (एनटीसी)
एक नियंत्रण प्रतिक्रिया जिसमें टेम्पलेट को छोड़कर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के सभी आवश्यक घटक शामिल होते हैं, जिसे आमतौर पर पानी से बदल दिया जाता है।एनटीसी के उपयोग से अभिकर्मक संदूषण या विदेशी डीएनए के कारण होने वाले संदूषण का पता लगाया जा सकता है, जिससे पता लगाने वाले डेटा की प्रामाणिकता और विश्वसनीयता सुनिश्चित होती है।एनटीसी नियंत्रण का प्रवर्धन संदूषण को इंगित करता है।

कोई आरटी नियंत्रण नहीं (एनआरटी)
आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया में अवशिष्ट जीनोमिक डीएनए शामिल हो सकता है, जो बेहद हानिकारक है और डेटा गुणवत्ता और क्यूपीसीआर के प्राकृतिक दुश्मन को प्रभावित करने वाला अपराधी है, इसलिए प्रयोगों को डिजाइन करते समय, इसे केवल आरएनए पहचान को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए।दो तरीके हैं, एक है इंट्रोन्स पर प्राइमर डिज़ाइन करना, दूसरा है डीएनए को पूरी तरह से हटाना, कौन सा बेहतर है, जिस पर बाद में चर्चा की जाएगी।डीएनए प्रदूषण का पता लगाने के लिए एनटीआर नियंत्रण एक जादुई दर्पण है।यदि प्रवर्धन है, तो इसका मतलब है कि प्रदूषण है।

मानकों
मानक ज्ञात सांद्रता या प्रतिलिपि संख्या के नमूने हैं जिनका उपयोग मानक वक्र बनाने के लिए किया जाता है।मानक की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, जीन टुकड़े को आमतौर पर प्लास्मिड में क्लोन किया जाता है और मानक के रूप में उपयोग किया जाता है।

मानक वक्र
आमतौर पर दोहरीकरण अनुपात के अनुसार मानक उत्पाद के साथ कम से कम 5 एकाग्रता ग्रेडियेंट में पतला होता है, और 5 अंक सीटी मान और प्रतिलिपि संख्या के निर्देशांक में खींचे जाते हैं, और अंक एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए एक रेखा बनाने के लिए जुड़े होते हैं।प्रत्येक मानक वक्र के लिए, उसकी वैधता की जाँच की जानी चाहिए।ढलान मान -3.3 और -3.8 के बीच आता है, और प्रत्येक सांद्रता तीन प्रतियों में प्रदर्शित की जाती है।जो बिंदु अन्य बिंदुओं से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न हैं उन्हें हटा दिया जाना चाहिए।परीक्षण किए जाने वाले नमूने का सीटी मान मानक वक्र में लाया जाता है, और परीक्षण किए जाने वाले नमूने के अभिव्यक्ति स्तर की गणना की जा सकती है।

परीक्षण किए जाने वाले नमूने का सीटी मान मानक वक्र में लाया जाता है, और परीक्षण किए जाने वाले नमूने की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की गणना की जा सकती है।

दक्षता और ढलान
मानक वक्र का ढलान वास्तविक समय पीसीआर की दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है।
· -3.322 की ढलान इंगित करती है कि पीसीआर प्रवर्धन दक्षता 1, या 100% कुशल है, और प्रत्येक चक्र पर पीसीआर उत्पाद की मात्रा दोगुनी हो जाती है।
-3.322 (उदाहरण के लिए, -3.8) से कम ढलान पीसीआर दक्षता को इंगित करता है
-3.322 (उदाहरण के लिए, -3.0) से अधिक ढलान इंगित करता है कि पीसीआर दक्षता 100% से अधिक प्रतीत होती है, जो दिलचस्प है, पीसीआर का एक चक्र प्रवर्धित उत्पाद को दोगुने से अधिक कैसे उत्पन्न कर सकता है?यह स्थिति पीसीआर प्रतिक्रिया के गैर-रेखीय चरण में होती है, यानी बड़ी मात्रा में गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होता है।

पिघलने की अवस्था
क्यूपीसीआर प्रवर्धन पूरा होने के बाद, पीसीआर उत्पाद को गर्म किया जाता है।जैसे-जैसे तापमान बढ़ता है, डबल-स्ट्रैंडेड प्रवर्धन उत्पाद धीरे-धीरे पिघलता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी आती है।जब एक निश्चित तापमान (टीएम) तक पहुंच जाता है, तो बड़ी संख्या में उत्पाद पिघल जाएंगे।प्रतिदीप्ति तेजी से गिरती है।विभिन्न पीसीआर उत्पादों में अलग-अलग टीएम मान और अलग-अलग पिघलने का तापमान होता है, ताकि पीसीआर की विशिष्टता की पहचान की जा सके।

पिघलने की अवस्था (व्युत्पन्न वक्र)
पिघलने की अवस्था एक शिखर मानचित्र बनाने के लिए निकाली गई है, जो पीसीआर उत्पाद के टुकड़ों की स्थिति को अधिक सहजता से प्रदर्शित कर सकती है।चूँकि पिघलने का तापमान डीएनए टुकड़े का टीएम मान है, डीएनए टुकड़े के टीएम मान को प्रभावित करने वाले कुछ मापदंडों का अनुमान लगाया जा सकता है, जैसे कि टुकड़े का आकार, जीसी सामग्री, आदि। सामान्यतया, हमारे प्राइमर डिजाइन सिद्धांतों के अनुसार,प्रवर्धित उत्पाद की लंबाई 80-300bp की सीमा में है, इसलिए पिघलने का तापमान 80°C और 90°C के बीच होना चाहिए।

पिघलने की अवस्था की व्याख्या: यदि एकमात्र मुख्य शिखर 80°C-90°C के बीच दिखाई देता है, तो इसका मतलब है कि फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर एकदम सही है;यदि मुख्य शिखर 80°C-90°C के बीच दिखाई देता है और विविध शिखर 80°C से नीचे दिखाई देता है, तो मूल रूप से प्राइमर डिमर पर विचार किया जाता है।आप इसे हल करने के लिए एनीलिंग तापमान को बढ़ाने का प्रयास कर सकते हैं;यदि मुख्य शिखर 80°C-90°C के बीच दिखाई देता है, और तापमान बढ़ने पर विविध शिखर फिर से दिखाई देता है, तो मूल रूप से यह माना जाता है कि डीएनए संदूषण है, और प्रयोग के प्रारंभिक चरण में डीएनए को हटाने की आवश्यकता है।

निःसंदेह, अभी भी कुछ असामान्य स्थितियाँ हैं, जिनका विवरण नीचे एक-एक करके दिया जाएगा।
3. उन्नत ज्ञान

क्यूपीसीआर करने के लिए, मुझे MIQE कहना होगा,न्यूनतम जानकारीके प्रकाशन हेतुमात्रात्मकवास्तविक समय पीसीआरप्रयोग-वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर के बारे में लेख प्रकाशित करने के लिए न्यूनतम जानकारीप्रयोग.सभी की समझ को सरल बनाने के लिए, हम मुख्य सामग्री को सरल बनाएंगे।

आप इंटरनेट पर MIQE का मूल पाठ खोज सकते हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि यह निर्धारित करता हैडेटा चेकलिस्ट जिसे किसी लेख को प्रकाशित करते समय प्रदान करने की आवश्यकता होती है .

समीक्षक इन विवरणों को पढ़कर प्रयोग की गुणवत्ता का आकलन कर सकते हैं;भावी पाठक प्रयोग को दोहराने या सुधारने के लिए भी इसका उपयोग कर सकते हैं।
ध्यान देने योग्य बात यह है कि इस सूची में प्रत्येक सूची के महत्व को क्रमशः E या D से अंकित किया गया है।इसका मतलब क्या है?ई: आवश्यक जानकारी (प्रस्तुत की जानी चाहिए);डी: वांछनीय जानकारी (जितना संभव हो उतना प्रदान करें)।

MIQE (1)-प्रायोगिक डिज़ाइन
कई बदमाश जिन्होंने अपनी स्नातक की पढ़ाई पूरी करने के बाद अपना बचाव पूरा कर लिया है, उन्हें यह नहीं पता होगा कि स्वतंत्र रूप से एक प्रयोग कैसे डिजाइन किया जाए, अपनी नोटबुक कैसे खोलें और शिक्षक उन्हें क्या करने के लिए कहें।परिणामस्वरूप, प्रयोगात्मक डिज़ाइन कठोर नहीं था, और पत्रिका के संपादकीय विभाग ने कहा कि वे इस चित्र और उस चित्र को बनाना चाहते थे, इसलिए उन्होंने इसे घबराहट में बनाया।ऐसे बनते हैं बदमाश!

घर के करीब, प्रयोग का पहला सिद्धांत निर्धारित करना हैप्रायोगिक तर्क की कठोरता.सबसे बुनियादी बात प्रयोगात्मक डिजाइन है, और प्रयोगात्मक डिजाइन के बारे में सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि लक्ष्य नमूना, संदर्भ नमूना (नियंत्रण), और दोहराव की संख्या कैसे निर्धारित की जाए, ताकि प्रयोगात्मक डेटा को संदर्भित, तुलनीय और आश्वस्त किया जा सके।

लक्ष्य नमूनाउस नमूने को संदर्भित करता है जिसके लिए हमें एक निश्चित उपचार के बाद लक्ष्य जीन का पता लगाने की आवश्यकता होती है।संदर्भ नमूनाबिना किसी उपचार के नमूना है, जिसे अक्सर जीव विज्ञान में जंगली प्रकार के रूप में जाना जाता है।

प्रायोगिक प्रतिकृतिबहुत महत्वपूर्ण हैं.आम तौर पर, प्रेरक प्रतिकृतियों की संख्या तीन से अधिक होनी चाहिए।यह अंतर करना आवश्यक है कि जैविक प्रतिकृति क्या है और तकनीकी प्रतिकृति क्या है।

जैविक प्रतिकृति: विभिन्न सामग्रियों (समय, पौधे, बैच, प्रतिक्रिया प्लेट) के साथ एक ही सत्यापन प्रयोग किया गया।

जैविक दोहराव
आइए उदाहरण के तौर पर काली मिर्च के कीटनाशक उपचार को लें।हम एबीसी के तीन पौधों पर कीटनाशकों का छिड़काव करना चाहते हैं, तो एबीसी के तीन पौधे तीन जैविक प्रतिकृति हैं, और वे विभिन्न सामग्रियों के साथ किए गए एक ही सत्यापन प्रयोग हैं।लेकिन एक प्रयोग के रूप में, एक नियंत्रण की निश्चित रूप से आवश्यकता होती है, इसलिए हम पौधे ए का प्रायोगिक समूह बनाने के लिए पौधे ए की शाखाओं में से एक का छिड़काव कर सकते हैं, और नियंत्रण समूह बनाने के लिए पौधे ए की अन्य शाखाओं का छिड़काव नहीं कर सकते हैं।बी और सी के लिए भी ऐसा ही करें।

तकनीकी प्रतिकृति: यह एक बार-बार किया जाने वाला प्रयोग है जिसे ऑपरेशन के कारण होने वाली त्रुटियों से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो वास्तव में एक ही सामग्री में शामिल एक डुप्लिकेट छेद है।उपचार और नियंत्रण दोनों में लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन की प्रतिकृति सेटिंग्स (न्यूनतम तीन) होनी चाहिए।

तकनीकी पुनरावृत्ति
उदाहरण के तौर पर कीटनाशकों से उपचारित काली मिर्च को फिर से लें।पौधे ए के प्रायोगिक समूह के लिए, हमने उसके लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन के लिए क्रमशः 1, 2 और 3 के तीन पीसीआर छेद बनाए, ताकि पता लगाने के बाद औसत लिया जा सके।पौधे के नियंत्रण के लिए ए समूह का भी इसी प्रकार उपचार किया जाता है।इसी प्रकार बी और सी पौधों का भी यही उपचार करें।यह तकनीकी दोहराव है.

यह ध्यान देने लायक हैजो आँकड़ों में प्रवेश करता है वह जैविक पुनरावृत्ति है, और तकनीकी पुनरावृत्ति यह परीक्षण करने के लिए है कि प्रयोगात्मक प्रक्रिया में कोई यादृच्छिक घटनाएँ हैं या नहीं, ताकि प्रयोगात्मक परिणामों को विश्वसनीय बनाया जा सके, अर्थात उनका औसत लेकर त्रुटियों से बचा जा सके जैसा कि हम अक्सर कहते हैं।

नकारात्मक नियंत्रण-एनटीसी और एनआरटी
एनटीसी (नो-टेम्पलेट नियंत्रण), बिना टेम्पलेट वाला एक नियंत्रण, यह सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि प्रायोगिक सामग्री दूषित है या नहीं।आम तौर पर, पानी का उपयोग टेम्पलेट के रूप में किया जाता है।यदि कोई फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया होती है, तो यह इंगित करता है कि प्रयोगशाला में न्यूक्लिक एसिड संदूषण हुआ है।

ये प्रदूषण आते हैं: अशुद्ध पानी, अंतर्जात डीएनए युक्त अयोग्य अभिकर्मक, प्राइमर प्रदूषण, प्रयोगशाला उपकरण प्रदूषण, एयरोसोल प्रदूषण, आदि, RNase स्केवेंजर्स और RNase अवरोधकों का उपयोग करने की आवश्यकता है।एरोसोल प्रदूषण का पता लगाना सबसे कठिन है।कल्पना कीजिए कि आपकी प्रयोगशाला धुंध की तरह है, जिसमें विभिन्न न्यूक्लिक एसिड हवा में निलंबित हैं।

एनआरटी (नो-रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस), रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन के बिना नियंत्रण, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर-रिवर्स ट्रांस्क्राइब्ड आरएनए है, जो जीडीएनए अवशेषों का नियंत्रण है।

जीन अभिव्यक्ति करते समय, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद सीडीएनए की मात्रा का पता लगाकर आरएनए की मात्रा का पता लगाया जाता है।यदि आरएनए को शुद्ध करने पर जीडीएनए अवशेष है, तो यह प्रयोगात्मक परिणामों में त्रुटियों का कारण बनेगा, क्योंकि प्राप्त वास्तविक परिणाम जीडीएनए और सीडीएनए हैं।समग्र स्तर पर, केवल सीडीएनए ही नहीं, आरएनए निष्कर्षण के दौरान जीडीएनए को भी पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता होती है।

एमआईक्यूई (2)-नमूना जानकारी
तथाकथित नमूना जानकारी का अर्थ है कि जब हम क्यूपीसीआर के बारे में एक लेख प्रकाशित करते हैं, तो हमें नमूना जानकारी को स्पष्ट रूप से समझाना चाहिए, जो लेख का एक अनिवार्य हिस्सा है।इसी तरह, जब हम नमूनों को संसाधित करते हैं, तो हमें नमूनों की वैधता सुनिश्चित करने के लिए अपने स्वयं के संचालन को भी विनियमित करना चाहिए।

नमूने का वर्णन केवल एक परिणाम है, और हमें पूरे प्रयोग के दौरान ली गई सामग्रियों पर अधिक ध्यान देना चाहिए।

प्रायोगिक सामग्री का चयन
रक्त के नमूने - ताजा रक्त चुनें, 4 घंटे से अधिक नहीं।कोशिका के नमूने - तीव्र वृद्धि की अवधि में ताज़ा कोशिकाएँ एकत्र करना चुनें।पशु ऊतक—ताजा, तेजी से बढ़ने वाले ऊतक चुनें।पौधे के ऊतक - ताज़ा, युवा ऊतक चुनें।

आपने देखा होगा कि इन कुछ वाक्यों में एक प्रमुख शब्द है: ताज़ा।
उपरोक्त नमूनों के लिए, बाजार में सबसे अच्छी, लागत प्रभावी और स्थिर किट फोरजीन की किट है, जो उनके डीएनए और आरएनए को जल्दी और आसानी से निकाल सकती है।

रक्त डीएनए मिनी किट

सेल टोटल आरएनए आइसोलेशन किट

पशु कुल आरएनए अलगाव किट

प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट

प्लांट टोटल आरएनए आइसोलेशन किट प्लस

प्लांट डीएनए आइसोलेशन किट

प्रायोगिक सामग्री का भंडारण
सामान्यतया, यदि परिस्थितियाँ अनुमति देती हैं तो हम नमूनों को संग्रहीत करने की अनुशंसा नहीं करते हैं।हालाँकि, ऐसे कई दोस्त हैं जो नमूना लेने के तुरंत बाद प्रयोग नहीं कर सकते हैं, और कुछ को नमूना लेने के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक को मैदान में ले जाने की भी आवश्यकता होती है।

इस प्रकार के परिश्रमी मित्र के लिए, मैं केवल यह कह सकता हूँ कि आप अभिकर्मक उपभोग्य सामग्रियों को नहीं समझते हैं।अब कई अभिकर्मक उपभोज्य कंपनियां ऐसे अभिकर्मकों का उत्पादन करती हैं जो आरएनए नमूनों को कमरे के तापमान पर संग्रहीत कर सकते हैं, और आप उनका उपयोग करना चुन सकते हैं।पारंपरिक भंडारण विधि तरल नाइट्रोजन भंडारण है, जिसमें एक छोटे तरल नाइट्रोजन टैंक का उपयोग किया जाता है जिसे ले जाना आसान होता है।नमूने को प्रयोगशाला में वापस लाने के बाद, इसे -80°C रेफ्रिजरेटर में रखें।

आरएनए से जुड़े प्रयोगों के लिए, छह-शब्द सिद्धांत का पालन किया जाना चाहिए:कम तापमान, कोई एंजाइम नहीं,औरतेज़ .

निम्न तापमान की अवधारणा को समझना आसान है;एंजाइमों के बिना, RNase दुनिया में हर जगह है जिसमें हम रहते हैं (अन्यथा आप एचआईवी से मारे गए होते), इसलिए प्रयोग करते समय RNase से कैसे बचें यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण अवधारणा है;तेज़,दुनिया में ऐसा कोई कुंग फू नहीं है जिसे तोड़ा न जा सके, केवल गति को तोड़ा नहीं जा सकता.

इसलिए, एक मायने में, निष्कर्षण का समय जितना कम होगा, किट उतनी ही बेहतर होगी।क्यों करता हैफोरजीनकी किट गति पर जोर देती है, क्योंकि वे इसे अच्छी तरह से जानते हैं।

पुनश्च: कुछ लड़कियाँ बहुत सावधानी से प्रयोग करती हैं, लेकिन कई वर्षों के काम के बाद वे स्लैम डंक जितने अच्छे नहीं होते हैं।उन्हें लगता है कि ईश्वर अन्यायी है, दूसरों के बारे में शिकायत करते हैं और जीवन की तलाश में हैं।दरअसल, वह इसे समझ नहीं पाई।उसने आरएनए की अच्छी तरह से रक्षा नहीं की, और स्लैम डंक खिलाड़ी फुर्तीला था।जब वह प्रयोग कर रहे थे तो उन्होंने सोचा था कि वह स्लैम डंक को तीन बार, पांच बार और दो डिविजन के साथ खत्म करेंगे, लेकिन उन्होंने प्रयोग अच्छे से किया।

टिप्पणी: धीमी, RNase आक्रमण की अधिक संभावना।अपने आप को तेज़ होने के लिए कैसे प्रशिक्षित करें?कोई रास्ता नहीं है, बस अधिक अभ्यास करें।

विभिन्न प्रयोगों और विभिन्न नमूनों के लिए, अभी भी अधिक साहित्य पढ़ना और प्रसंस्करण के लिए एक उपयुक्त विधि चुनना आवश्यक है।नमूना संग्रह और भंडारण प्रक्रिया के लिए, एमआईक्यूई के लिए आवश्यक है कि इसे पेपर में स्पष्ट रूप से लिखा जाना चाहिए, ताकि समीक्षक पेपर की विश्वसनीयता की समीक्षा कर सकें, और स्तब्ध युवाओं के लिए आपके प्रयोग को दोहराना भी सुविधाजनक हो।

यद्यपि जैविक प्रयोग कठिन हैं, फिर भी वे उच्च कोटि के हैं।यदि आप सावधान नहीं हैं, तो आप दुनिया को पलट सकते हैं।उदाहरण के लिए, सार्स को जैव रासायनिक संकट बनाना, या 1.3 अरब लोगों को बचाने के लिए संकर चावल बनाना।नीचे दी गई तस्वीर एक रासायनिक प्रयोग है, आपको उसके डिक जैसी शक्ल देखकर ही समझ जाना चाहिए कि आपको अपने शोध पर कितना गर्व है।भूल जाओ, उसे काला मत करो।

एमआईक्यूई (3) - न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण।
न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण एक बड़ी घटना है, और सभी आणविक जीवविज्ञान प्रयोग न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से शुरू होते हैं।सबसे पहले, आइए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण पर MIQE की सामग्री की प्रतिलिपि बनाएँ।

इस फॉर्म को देखकर आप सतह पर नहीं रह सकते.रूप एक हठधर्मिता है.एक शीर्ष छात्र बनने के लिए, आपको अवश्य पूछना चाहिए कि क्यों।इस तालिका की आवश्यक सामग्री है: पीछा करनाआरएनए की शुद्धता, अखंडता, स्थिरता और निष्कर्षण मात्रा .

का पहला भागप्रक्रिया या उपकरण न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण चरण है।यदि आप निकालने के लिए एक स्वचालित न्यूक्लिक एसिड एक्सट्रैक्टर का उपयोग करते हैं (उन्नत, कृपया खरीद के लिए मुझसे संपर्क करें), तो आपको उपकरण का मॉडल नाम इंगित करना होगा।

किट का नाम और

परिवर्तन के विवरण के लिए किस किट का उपयोग किया गया, कौन से विशेष अभिकर्मक जोड़े गए या कौन से विशेष ऑपरेशन किए गए, यह स्पष्ट रूप से बताया जाना चाहिए ताकि अन्य लोग आसानी से आपके प्रयोग को दोहरा सकें।

कुछ लोग विशेष नमूने निकालते समय कुछ विशेष अभिकर्मकों को यह सोचकर मिलाते हैं कि यह उनका गुप्त हथियार है और दूसरों को नहीं बताते हैं।इसे गुप्त रखते हुए, वे आपके लेख को चमकाने का अवसर भी खो देते हैं।चतुर मत बनो, तुम्हें वैज्ञानिक अनुसंधान में देश के पुराने झांग से अधिक ईमानदार होना होगा, यदि तुम चतुर बनना चाहते हो, तो लेख तुम्हें मूर्ख बना देगा।

किट का उत्पाद क्रमांक अवश्य याद रखेंजब आप किट ऑर्डर करते हैं और लेख लिखते हैं।किट पर आम तौर पर दो नंबर होते हैं: कैट-कैटलॉग नंबर (उत्पाद संख्या, लेख संख्या), लॉट-उत्पाद लॉट नंबर (यह इंगित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि उत्पाद किस बैच से आया है)।

इसके अलावा, CAS नंबर का उपयोग अक्सर जैव रासायनिक अभिकर्मकों का ऑर्डर करते समय किया जाता है, और मैं इसे एक साथ लोकप्रिय बनाऊंगा।CAS नंबर अमेरिकन केमिकल सोसायटी द्वारा प्रत्येक नई रासायनिक दवा को दिया गया नंबर है।आम तौर पर, तीन नंबर एक डैश से जुड़े होते हैं।रुशुई का CAS नंबर: 7732-18-5.रसायनों के अक्सर कई उपनाम होते हैं, लेकिन CAS संख्या अद्वितीय होती है।दवा ऑर्डर करते समय आप सबसे पहले उसका CAS नंबर देख सकते हैं।

घर के करीब, हमें इन चीज़ों का स्पष्ट रूप से वर्णन क्यों करना पड़ता है?दरअसल, यह आरएनए निष्कर्षण की गुणवत्ता की जांच करने के लिए भी है।उपकरणों और किटों का उपयोग आरएनए निष्कर्षण को और अधिक सुसंगत बना देगा।सामान्य प्रयोगशालाओं का निष्कर्षण पैमाना बड़ा नहीं है, और इसे किट के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

DNase या RNase उपचार का विवरण
फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर का महत्वपूर्ण मुद्दा डीएनए संदूषण को रोकना है, और यदि संदूषण है तो प्रयोग न करें।इसलिए, यह बताना ज़रूरी है कि आपने डीएनए को संसाधित करने के लिए किस प्रक्रिया का उपयोग किया है, ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि प्रायोगिक प्रक्रिया में डीएनए को पूरी तरह से हटा दिया गया है।एक योजनाबद्ध आरेख द्वारा दर्शाया गया है।

आरएनए और डीएनए का योजनाबद्ध आरेख
सामान्य तौर पर, डीएनए को हटाने की विधि निष्कर्षण के बाद आरएनए को DNase के साथ उपचारित करना है।हालाँकि, ये अपेक्षाकृत पुराने तरीके हैं।वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट DNase को जोड़े बिना निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान डीएनए को हटाने में सक्षम हैं।उदाहरण के लिए, फोरजीन से किटों की एक श्रृंखला।

टिप्पणी: आरएनए निष्कर्षण के दौरान डीएनए को हटाना एक बहुत ही खतरनाक दोधारी तलवार है, जो आरएनए निष्कर्षण के संचालन समय को बढ़ा देगा और आरएनए क्षरण का खतरा बढ़ जाएगा।मूल रूप से, यह आरएनए उपज और शुद्धता के बीच एक समझौता है।

इसके अलावा, सिलिका-आधारित सोखना कॉलम में जोड़े गए DNase की मात्रा बहुत कम है, और प्रभाव को प्राप्त करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले DNase का उपयोग किया जाना चाहिए।अअनुकूलित DNase को जल्दी और पूरी तरह से पचाया नहीं जा सकता।यह व्यापारी के तकनीकी स्तर का परीक्षण है।बेशक, ऐसे और भी अजीब व्यापारी हैं जो दावा करते हैं कि डीएनए को DNase के बिना हटाया जा सकता है।यह कहा जा सकता है कि जो कोई भी यह दावा करता है कि DNase के बिना डीएनए को पूरी तरह से हटाया जा सकता है, वह गुंडा है।डीएनए एक अपेक्षाकृत स्थिर डबल-स्ट्रैंडेड संरचना है, और इसे केवल बात करने और हंसने से ख़त्म नहीं किया जा सकता है।

संदूषण मूल्यांकन
मूल्यांकन विधि: वैद्युतकणसंचलन का पता लगाना, 1% एगरोज़, 6 वी/सेमी, 15 मिनट, लोडिंग 1-3 उल

न्यूक्लिक एसिड मात्रात्मक विश्लेषण
आमतौर पर यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है।सबसे पहले मैं OD260, OD280 और OD230 के तीन मानों के अर्थ को लोकप्रिय बनाना चाहता हूँ।
·OD260nm: यह न्यूक्लिक एसिड के उच्चतम अवशोषण शिखर की अवशोषण तरंग दैर्ध्य है, और सबसे अच्छा मापा गया मान 0.1 से 1.0 तक होता है।यदि नहीं, तो नमूने को सीमा के भीतर लाने के लिए उसे पतला या सांद्रित करें।
·OD280nm: यह प्रोटीन और फेनोलिक पदार्थों के उच्चतम अवशोषण शिखर की अवशोषण तरंग दैर्ध्य है।
·OD230nm: यह कार्बोहाइड्रेट के उच्चतम अवशोषण शिखर की अवशोषण तरंग दैर्ध्य है।

आगे, आइए प्रत्येक संकेतक की भूमिका के बारे में बात करें।A260 के लिए, इसका उपयोग न्यूक्लिक एसिड की उपज को मापने के लिए किया जा सकता है।जब OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

शुद्धता के लिए, हमें उन अनुपातों को देखना होगा जो हम आमतौर पर देखते हैं: OD260/280 और OD260/230।
·शुद्ध डीएनए: OD260/280 लगभग 1.8 के बराबर है।जब यह 1.9 से अधिक होता है, तो यह इंगित करता है कि आरएनए प्रदूषण है, और जब यह 1.6 से कम है, तो यह इंगित करता है कि प्रोटीन और फिनोल प्रदूषण है।
·शुद्ध आरएनए: 1.7
·OD260/230: चाहे वह डीएनए हो या आरएनए, संदर्भ मान 2.5 है।जब यह 2.0 से कम होता है, तो यह इंगित करता है कि चीनी, नमक और कार्बनिक पदार्थों का प्रदूषण है।

आरएनए अखंडता

आरएनए की अखंडता को मापना बहुत महत्वपूर्ण है।आम तौर पर, यह जांचने के लिए आरएनए विकृतीकरण जेल प्रयोग करना आवश्यक है कि क्या 28एस और 18एस आरएनए के बीच चमक दो गुना संबंध है।जब तीसरा बैंड 5S प्रकट होता है, तो इसका मतलब है कि अकशेरुकी जीवों को छोड़कर, आरएनए का क्षरण शुरू हो गया है।

आरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए डेटा: उपरोक्त परीक्षणों के अलावा, आरएनए अखंडता के संदर्भ में कुछ और उन्नत उपकरण परीक्षण भी हैं, जैसे कि एक्सपीरियन स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का आरक्यूआई अखंडता परीक्षण, जो यह पता लगा सकता है कि क्या आरएनए अदृश्य रूप से नष्ट हो गया है।

वैज्ञानिक अनुसंधान में, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन के बीच तुलना है।इसलिए, आरएनए नमूना संरक्षण, आरएनए निष्कर्षण आदि की प्रक्रिया में, प्राथमिक लक्ष्य आरएनए की अखंडता सुनिश्चित करना है।

आरएनए की अखंडता लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन के बीच संतुलन को कैसे प्रभावित करती है, इसे नीचे दिए गए चित्र से आसानी से समझा जा सकता है।क्षरण से जीन अपूर्णता हो जाएगी, चाहे वह आंतरिक संदर्भ जीन की अपूर्णता हो या लक्ष्य जीन की अपूर्णता, इसका डेटा पर बहुत प्रभाव पड़ेगा।

लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन का योजनाबद्ध आरेख सत्य नहीं होना चाहिए

निषेध परीक्षण (चाहे सीटी मान उच्च या निम्न सांद्रता या अन्य स्थितियों के तहत दबाया गया हो)

इस आंकड़े को एक उदाहरण के रूप में लेते हुए, पांच वक्रों के सीटी मान इस प्रकार हैं।वक्रों के बीच सीटी मूल्यों का वितरण असमान है, और उच्च और निम्न सांद्रता के तहत सीटी मूल्यों में देरी होती है, जो पीसीआर निषेध का मामला है।

मुख्य बिंदु: आरएनए निष्कर्षण की प्रक्रिया में, हमें गलतफहमियों को त्यागने और सही गलतफहमियों को स्थापित करने की आवश्यकता है।

गलत विचार यह है: आरएनए निष्कर्षण केवल उपज का पीछा करता है, यह सोचकर कि आरएनए की जितनी बड़ी मात्रा प्राप्त होगी, उतना बेहतर होगा।वास्तव में, जब हम परिमाणीकरण करते हैं, यदि जीन की संख्या बहुत बड़ी नहीं है, तो हमें अधिक आरएनए की आवश्यकता नहीं होती है।आपके द्वारा निकाले गए आरएनए की मात्रा पर्याप्त से अधिक है।

सही अवधारणा है:आरएनए निष्कर्षण को शुद्धता, अखंडता और स्थिरता का पालन करना चाहिए.शुद्धता यह सुनिश्चित कर सकती है कि बाद में रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन बाधित नहीं होगा और डेटा डीएनए से प्रभावित नहीं होगा।सत्यनिष्ठा लक्ष्य अनुक्रमों और आंतरिक संदर्भों का संतुलन सुनिश्चित करती है।संगति स्थिर नमूना लोडिंग सुनिश्चित करती है।

एमआईक्यूई (4) - रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन
ग़लतफ़हमी: उच्च नमूना मात्रा की खोज।
सही अवधारणा: स्थिरता (स्थिरता) का पीछा करें, आरएनए लोड की मात्रा की परवाह किए बिना, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की दक्षता लगातार बनी रहती है, यह सुनिश्चित करते हुए कि सीडीएनए में अंतर वास्तव में एमआरएनए में अंतर को प्रतिबिंबित कर सकता है।
हम इस प्रक्रिया को एक योजनाबद्ध आरेख के साथ समझाते हैं:

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता का योजनाबद्ध आरेख, सत्य नहीं है
सबसे पहले, हमें रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया और पीसीआर प्रक्रिया के बीच अंतर को समझने की जरूरत है।पीसीआर कई हीटिंग और एनीलिंग प्रक्रियाओं से गुजरता है, और लक्ष्य टुकड़ा तेजी से बढ़ता है;जबकि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में यह प्रक्रिया नहीं होती है, हम कल्पना कर सकते हैं कि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन वास्तव में प्रतिकृति प्रक्रिया के दौरान आरएनए के कई टुकड़ों के रूप में एक-से-एक होता है।

चूंकि सीडीएनए जानकारी के कई टुकड़े मिल सकते हैं, इसलिए इसे अब तक समझा जाना चाहिए, क्योंकि बड़े और छोटे टुकड़ों को रिवर्स-ट्रांसक्राइब किया गया है, और एक टुकड़े पर ध्यान केंद्रित करना असंभव है।और क्योंकि आरएनए की मात्रा अपेक्षाकृत छोटी है, प्राप्त सीडीएनए की मात्रा भी पीसीआर के विपरीत अपेक्षाकृत छोटी है, जिसका प्रवर्धन प्रभाव होता है, इसलिए इसका पता लगाना मूल रूप से असंभव है।

सीडीएनए वैद्युतकणसंचलन परिणाम
दूसरे, आदर्श रूप से, रिवर्स ट्रांस्क्रिप्शन एक-से-एक किया जाता है, लेकिन किसी भी कंपनी का कोई भी रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ इस प्रभाव को प्राप्त नहीं कर सकता है।मूल रूप से, अधिकांश रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की दक्षता 30-50% के बीच घूमती है।यदि यह मामला है, तो हमारे पास अपेक्षाकृत स्थिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता होगी, जिसे हम चित्र में देखना चाहते हैं: 3 आरएनए को 2 सीडीएनए मिलते हैं, 6 आरएनए को 4 सीडीएनए मिलते हैं, इसलिए कोई फर्क नहीं पड़ता कि कितना नमूना लोड किया गया है, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता अपेक्षाकृत स्थिर है।हम ऐसी स्थिति नहीं देखना चाहते जहां रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता अस्थिर हो और उच्च सांद्रता बाधित हो।

तो, कैसे सत्यापित करें कि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता स्थिर है या नहीं?विधि बहुत सरल है, आपको केवल एक तुलनात्मक परीक्षण करने की आवश्यकता है: एक है आरएनए को दोगुना करने के बाद सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्राइब करना, और दूसरा है सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्राइब करने के बाद दोगुना डाइल्यूशन करना, और फिर प्राप्त ढलान को देखने के लिए क्यूपीसीआर करना क्या यह सुसंगत है।एक शीर्ष छात्र के रूप में, आपको इसे सेकंडों में समझ लेना चाहिए।जैसा कि नीचे दिया गया है:

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की दक्षता स्थिर है या नहीं यह जांचने के लिए आरएनए और सीडीएनए का पतला होना
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और किट
उत्तम फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर में उत्कृष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और किट कैसे हो सकती है।रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को स्रोत के अनुसार मोटे तौर पर दो प्रकारों में विभाजित किया गया है, एएमवी याएम MLV, और उनका प्रदर्शन वही है जो तालिका में दिखाया गया है।

RNase H गतिविधि
RNase H राइबोन्यूक्लिज़ H है, चीनी नाम राइबोन्यूक्लिज़ H है, जो एक एंडोरिबोन्यूक्लिज़ है जो विशेष रूप से DNA-RNA हाइब्रिड श्रृंखला में RNA को हाइड्रोलाइज़ कर सकता है।RNase H सिंगल-स्ट्रैंडेड या डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए या आरएनए में फॉस्फोडिएस्टर बॉन्ड को हाइड्रोलाइज नहीं कर सकता है, यानी यह सिंगल-स्ट्रैंडेड या डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए या आरएनए को पचा नहीं सकता है।आमतौर पर सीडीएनए के दूसरे स्ट्रैंड के संश्लेषण में उपयोग किया जाता है।

यह एक अजीब बात है.हम कहते हैं कि रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में RNase H गतिविधि होती है, ऐसा नहीं है कि रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में RNase H होता है, और RNase H को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस से अलग करना संभव नहीं हो सकता है, शायद रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में कुछ समूहों की संरचना के कारण यह गतिविधि रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के कारण होती है।

इसलिए, AMV की उच्च रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता की परवाह किए बिना, इसकी RNase H गतिविधि सीडीएनए की उपज को कम कर देती है।बेशक, अभिकर्मक निर्माता सीडीएनए की उपज बढ़ाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में आरएनएएस एच गतिविधि को जितना संभव हो सके खत्म करने के लिए अपने उत्पादों को लगातार अनुकूलित कर रहे हैं।
एनीलिंग तापमान

विभिन्न तापमानों पर आरएनए की माध्यमिक संरचना
विभिन्न तापमानों पर आरएनए की द्वितीयक संरचना के लिए उपरोक्त चित्र देखें, और विशिष्ट तापमान और नमक सांद्रता स्थितियों के तहत लक्ष्य टुकड़े की द्वितीयक संरचना निर्धारित करने के लिए एमफोल्ड ऑनलाइन टूल का उपयोग करें।55°C पर, RNA की द्वितीयक संरचना अभी भी बहुत जटिल है, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस काम नहीं कर सकता है, और द्वितीयक संरचना 65°C तक पूरी तरह से हल नहीं हो सकती है, जबकि AMV और M-MLV का इष्टतम तापमान इस तापमान से बहुत कम है।
क्या करें?द्वितीयक संरचना स्वयं टेम्प्लेट की पूरक जोड़ी है, जिससे प्राइमर और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और टेम्प्लेट के बीच मजबूत प्रतिस्पर्धा होती है, जिसके परिणामस्वरूप कम ई और खराब दोहराव जैसी समस्याओं की एक श्रृंखला होती है।

क्या करें?केवल एनीलिंग तापमान को जितना संभव हो उतना बढ़ाएं।

कई अभिकर्मक निर्माता आनुवंशिक इंजीनियरिंग के माध्यम से अपने रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में सुधार कर रहे हैं।कुछ प्रतिक्रिया तापमान बढ़ाते हैं, जैसे कि जिफान और ऐडेलाई, और कुछ एंजाइम और आरएनए टेम्पलेट के बीच संबंध को बेहतर बनाने के लिए आरएनएएस एच एंजाइम के सक्रिय समूह को हटा देते हैं।उच्च आत्मीयता प्रतिस्पर्धात्मक रूप से द्वितीयक संरचना को निचोड़ सकती है और आसानी से पढ़ सकती है, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की दक्षता में भी काफी सुधार कर सकती है।
मुख्य बिंदु: लोड किए गए नमूने की मात्रा के बजाय रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता (एंजाइम न केवल कुशल बल्कि स्थिर भी होना चाहिए) की स्थिरता को आगे बढ़ाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अधिक महत्वपूर्ण है, यदि यह विशेष रूप से बड़े पैमाने पर फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर नहीं है, तो यह बिल्कुल भी संभव नहीं होगा।एकाधिक सीडीएनए.
विभिन्न निर्माताओं ने भी निरंतरता की खोज में कुछ प्रयास किए हैं।उदाहरण के लिए, अधिकांश कंपनियों ने अब बिक्री के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को एक मानक किट के रूप में पैक किया है, जो एक अच्छा विकल्प है।
उदाहरण के लिए, फोरेजीन की आरटी ईज़ी सीरीज़ किट:

आरटी ईज़ी I (प्रथम स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण किट के लिए मास्टर प्रीमिक्स)

एमआईक्यूई (5) - लक्ष्य जीन जानकारी

उपरोक्त चित्र बताता है
1. यह जीन बार-बार किए जाने वाले प्रयोगों के लिए प्रभावी है या नहीं, इसे आम तौर पर बार-बार किए गए प्रयोगों द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।
2. जीन आईडी, आप जानते हैं।
3. जीन की लंबाई, लक्ष्य जीन की कुल लंबाई निश्चित रूप से कोई समस्या नहीं है।प्राइमर डिज़ाइन करते समय, सुनिश्चित करें कि बेहतर प्रवर्धन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए एम्प्लिकॉन की लंबाई 80-200bp के बीच हो।
4. अनुक्रम ब्लास्ट तुलना जानकारी, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को रोकने के लिए लक्ष्य जीन की जीनबैंक में तुलना करने की आवश्यकता है।
5. स्यूडोजेन की उपस्थिति.स्यूडोजेन एक सामान्य जीन के समान एक डीएनए अनुक्रम है लेकिन यह अपना सामान्य कार्य खो देता है।यह अक्सर यूकेरियोट्स के बहु-जीन परिवार में मौजूद होता है।इसे आमतौर पर ψ द्वारा दर्शाया जाता है।यह जीनोम में एक गैर-कार्यात्मक जीनोमिक डीएनए प्रतिलिपि है जो कोडिंग जीन अनुक्रम के समान है।, आम तौर पर लिखित नहीं होते हैं, और इनका कोई स्पष्ट शारीरिक अर्थ नहीं होता है।
6. एक्सॉन और इंट्रॉन के सापेक्ष प्राइमरों की स्थिति।प्रारंभिक वर्षों में, जब हमने डीएनए संदूषण की समस्या को हल किया, तो हमने अक्सर प्राइमर, एक्सॉन और इंट्रॉन की स्थिति पर ध्यान दिया, और आम तौर पर डीएनए प्रवर्धन से बचने के लिए इंट्रॉन में प्राइमर डिजाइन करने पर विचार किया।कृपया नीचे दिए गए चित्र को देखें: काला इंट्रॉन का प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न नीले रंग एक्सॉन का प्रतिनिधित्व करते हैं, गुलाबी सामान्य प्राइमरों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और चमकदार लाल इंट्रॉन-स्पैनिंग प्राइमरों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

योजनाबद्ध, कभी सत्य नहीं
यह कितनी सटीक योजना लगती है, लेकिन वास्तव में, ज्यादातर मामलों में, ट्रांस-इंट्रोन प्राइमर उतने जादुई नहीं हैं जितनी कल्पना की गई थी, और वे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कारण भी बनेंगे।इसलिए डीएनए संदूषण को रोकने का सबसे अच्छा तरीका डीएनए को पूरी तरह से हटा देना है।
7. संरचना भविष्यवाणी.इस उदाहरण का दोबारा उपयोग करते हुए, एक विशिष्ट तापमान और नमक सांद्रता पर लक्ष्य टुकड़े की द्वितीयक संरचना निर्धारित करने के लिए एमफोल्ड ऑनलाइन टूल का उपयोग करें।

विभिन्न तापमानों पर आरएनए की माध्यमिक संरचना
द्वितीयक संरचना स्वयं टेम्प्लेट की पूरक जोड़ी है, जिससे प्राइमर और टेम्प्लेट पेयरिंग के बीच मजबूत प्रतिस्पर्धा होगी और प्राइमर बाइंडिंग की संभावना कम होगी, जिसके परिणामस्वरूप कम ई और खराब दोहराव जैसी समस्याओं की एक श्रृंखला होगी।सॉफ़्टवेयर पूर्वानुमान के माध्यम से, यदि कोई द्वितीयक संरचना समस्या नहीं है, तो यह बहुत अच्छा होगा।यदि ऐसा है, तो हमारा अनुवर्ती लेख विशेष रूप से चर्चा करेगा कि इस समस्या को कैसे हल किया जाए।

एमआईक्यूई (6)-क्यूपीसीआर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स

फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर के लिए, पहली चीज जिसके साथ आप हर दिन संघर्ष करते हैं वह आरएनए निष्कर्षण है, और दूसरी चीज प्राइमर डिजाइन हो सकती है।
सबसे पहले, हम अभी भी MIQE चेकलिस्ट के अनुसार प्राइमर डिज़ाइन के नियमों की जाँच करते हैं।यह इतना सरल है कि बदमाश हंस सकते हैं, और हम इसे एक वाक्य में समाप्त कर सकते हैं: प्राइमर जांच के अनुक्रम और स्थिति और संशोधन विधि का पता लगाएं।प्राइमर शुद्धिकरण विधि के लिए, प्राइमर संश्लेषण वर्तमान में इतना सस्ता है, क्यूपीसीआर पेज और उपरोक्त शुद्धि विधियों के योग्य है, और संश्लेषण उपकरण की जानकारी महत्वपूर्ण नहीं है।बहुत से लोग दशकों से प्राइमर कर रहे हैं और नहीं जानते कि सिंथेसाइज़र ABI3900 है।
प्राइमर डिज़ाइन के सिद्धांतों के संबंध में, आपको उन्हें रटने की ज़रूरत नहीं है, क्योंकि अधिकांश प्राइमर डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर या ऑनलाइन टूल इन समस्याओं का ध्यान रख सकते हैं (अनुशंसित ऑनलाइन टूल primer3.ut.ee/), और 99.999% प्राइमर डिज़ाइन मैन्युअल रूप से नहीं किया जाता है, लेखक कभी-कभी एक दिन में सैकड़ों प्राइमर डिज़ाइन करता है, यदि आप एक-एक करके पढ़ेंगे, तो यह क्रॉस-आइड हो जाएगा।
प्राइमर डिज़ाइन करने के बाद बस निम्नलिखित बिंदुओं की जाँच करें:
1. प्राइमर को 3′ सिरे के करीब डिजाइन करें: सीडीएनए प्रथम-स्ट्रैंड संश्लेषण के लिए ओलिगो डीटी प्राइमर का उपयोग करने के मामले में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता और आरएनए अखंडता को ध्यान में रखते हुए, डिज़ाइन किए गए प्राइमरों को प्रवर्धन दक्षता में सुधार के लिए 3′ सिरे के करीब डिजाइन करने की आवश्यकता है।इस प्रकार समझाने के लिए एक चित्र का उपयोग करें (इसे समझने का कोई तरीका नहीं है):

प्राइमरों को 3′ सिरे के करीब क्यों डिज़ाइन किया जाना चाहिए, यह सत्य नहीं होना चाहिए
2. टीएम मान: टीएम मान 55-65°C पर है (क्योंकि एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि 60°C पर सबसे अधिक है), और GC सामग्री 40%-60% पर है।
3. ब्लास्ट: जीनोम के गैर-विशिष्ट प्रवर्धन से बचने के लिए, पूरक सत्यापन के लिए ब्लास्ट का उपयोग किया जाना चाहिए।

एमआईक्यूई(7)-क्यूपीसीआर प्रक्रिया

1. क्यूपीसीआर किट
MIQE की आवश्यकताओं के अनुसार, हमें लेख में संपूर्ण प्रतिक्रिया स्थितियों का स्पष्ट रूप से वर्णन करना चाहिए, जिसमें पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली का विन्यास, किस किट का उपयोग किया जाता है, निर्माता कौन है, प्रतिक्रिया प्रणाली कितनी बड़ी है, क्या डाई विधि या जांच विधि का उपयोग किया जाता है, पीसीआर कार्यक्रम सेटिंग्स।अनुभवी ड्राइवर निश्चित रूप से पाएंगे कि जब तक किट का चयन किया जाता है, उपरोक्त जानकारी मूल रूप से निर्धारित होती है।
वर्तमान में, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर किट का निर्माण और उत्पादन एक बहुत ही परिपक्व तकनीक है।जब तक आप बेहद खराब निर्माताओं को नहीं चुनते हैं, तब तक समस्याओं की संभावना अधिक नहीं है, लेकिन फिर भी हम आपके साथ कुछ बातें साझा करना चाहते हैं:
हॉट-स्टार्ट टैक एंजाइम:पीसीआर का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा हॉट-स्टार्ट टाक एंजाइम है।बाजार में हॉट-स्टार्ट एंजाइम आम तौर पर दो प्रकारों में विभाजित होते हैं, एक रासायनिक रूप से संशोधित हॉट-स्टार्ट एंजाइम है (आप इसे पैराफिन एम्बेडिंग के रूप में कल्पना कर सकते हैं), और दूसरा एंटीबॉडी संशोधन (एंटीजन-एंटीबॉडी बाइंडिंग) के लिए एक हॉट-स्टार्ट एंजाइम है।रासायनिक संशोधन गर्म-प्रारंभिक एंजाइमों का एक प्रारंभिक तरीका है।जब एक निश्चित तापमान पहुंच जाता है, तो एंजाइम अपनी गतिविधि जारी कर देगा।एंटीबॉडी-संशोधित हॉट-स्टार्ट एंजाइम एंजाइम की गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए जैविक तरीकों का उपयोग करता है।जब एक निश्चित तापमान पहुंच जाता है, तो एंटीबॉडी विकृत हो जाएगी और प्रोटीन के रूप में निष्क्रिय हो जाएगी, और एंजाइम गतिविधि को काम में लाया जाएगा।

हालाँकि, इसका उपयोग क्या है?यह मामला है, एंटीबॉडी-संशोधित एंजाइमों की रिलीज गतिविधि रासायनिक रूप से संशोधित एंजाइमों की तुलना में तेज़ है, इसलिए संवेदनशीलता के संदर्भ में, एंटीबॉडी-संशोधित एंजाइमों का थोड़ा फायदा होता है, ताकि बाजार में किटों में मूल रूप से कोई रासायनिक रूप से संशोधित एंजाइम न हों।यदि है तो इस निर्माता की तकनीक अभी भी सहस्राब्दी युग में अटकी हुई है।
मैग्नीशियम आयन सांद्रता:पीसीआर प्रतिक्रिया में मैग्नीशियम आयन सांद्रता बहुत महत्वपूर्ण है।उचित मैग्नीशियम आयन सांद्रता टैक एंजाइम गतिविधि की रिहाई को बढ़ावा दे सकती है।यदि सांद्रता बहुत कम है, तो एंजाइम गतिविधि काफी कम हो जाएगी;यदि सांद्रता बहुत अधिक है, तो एंजाइम-उत्प्रेरित गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बढ़ाया जाएगा।मैग्नीशियम आयनों की सांद्रता प्राइमरों की एनीलिंग, टेम्पलेट और पीसीआर उत्पादों के पिघलने के तापमान को भी प्रभावित करेगी, जिससे प्रवर्धित टुकड़ों की उपज प्रभावित होगी।मैग्नीशियम आयनों की सांद्रता आम तौर पर 25mM पर नियंत्रित होती है।बेशक, एक अच्छी किट के लिए, मैग्नीशियम आयनों की सांद्रता को अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाना चाहिए।कुछ व्यापारी अभिकर्मक में मैग्नीशियम आयन चेलेटिंग एजेंट जोड़ते हैं, जो मैग्नीशियम आयन एकाग्रता के स्वचालित समायोजन के प्रभाव को प्राप्त कर सकता है।
फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता:फ्लोरोसेंट डाई, जो कि एसवाईबीआर ग्रीन है जिसका हम आमतौर पर उपयोग करते हैं, मुख्य रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के छोटे खांचे से जुड़कर प्रतिदीप्ति उत्पन्न करता है, क्योंकि डाई का डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए से बंधन गैर-विशिष्ट है, यानी जब तक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए इसके साथ संयुक्त होता है, तब तक प्रतिदीप्ति हो सकती है, इसलिए सिस्टम में प्राइमर-डिमर्स और डीएनए टेम्पलेट पृष्ठभूमि सिग्नल बनाने के लिए इसके साथ जुड़ जाएंगे।
पुनश्च: इसके प्रकाश-संवेदनशील गुणों के कारण, बाजार में उत्पाद आम तौर पर भूरे अपारदर्शी सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पैक किए जाते हैं (जैसा कि नीचे दी गई तस्वीर में दिखाया गया है)।हालाँकि, इससे एक समस्या का सामना करना पड़ेगा।नमूना लेते समय यह देखना मुश्किल है कि तरल पदार्थ चूसा गया है या नहीं।इस संबंध में, किंग्के वास्तव में सबसे अधिक उपयोगकर्ता-अनुकूल है (जैसा कि नीचे दी गई तस्वीर में दिखाया गया है), और पारदर्शी ट्यूब एक अपारदर्शी टिन बैग में पैक की जाती है।फिर रोशनी और सैंपलिंग से बचने की सुविधा को ध्यान में रखते हुए इसे एक टिन बैग में रख दें।आपको सही उत्पाद संख्या चुननी होगी.टीएसई204 एक सुपर लागत प्रभावी अस्तित्व है, जो मुझे घास लगाने के लिए प्रेरित करता है।

फ्लोरोसेंट डाई की सांद्रता भी बहुत महत्वपूर्ण है।यदि सांद्रता बहुत कम है, तो प्रवर्धन वक्र बाद के चरण में ऊपर नहीं जाएगा और सही नहीं होगा;यदि सांद्रता बहुत अधिक है, तो यह शोर हस्तक्षेप का कारण बनेगी।चूंकि फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर मुख्य रूप से सीटी मान पर निर्भर करता है, यदि फ्लोरोसेंट डाई की एकाग्रता को ठीक से समायोजित नहीं किया जाता है, तो निम्न बिंदु उच्च बिंदु से बेहतर है।निःसंदेह, उचित डाई सांद्रता सर्वोत्तम है।

रोक्स: आरओएक्स रंगों का उपयोग अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति सिग्नल त्रुटियों को ठीक करने के लिए किया जाता है।कुछ उपकरण निर्माताओं को अंशांकन की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य को नहीं।उदाहरण के लिए, थर्मो फिशर साइंटिफिक के रियल टाइम पीसीआर एम्प्लीफिकेशन उपकरण के उपयोग के लिए आमतौर पर अंशांकन की आवश्यकता होती है, जिसमें 7300, 7500, 7500फास्ट, स्टेपवनप्लस आदि शामिल हैं। सामान्य किट निर्देश इसका वर्णन करेंगे।
फोरेजीन के क्यूपीसीआर मिक्स में आरओएक्स डाई भी शामिल है, जो विभिन्न मॉडलों में उपयोग के लिए सुविधाजनक है।

रियल टाइम पीसीआर किट-ताकमान

कमजोर हाइड्रोजन बांड उपचार: कमजोर हाइड्रोजन बांड का उपचार एक अपेक्षाकृत तकनीकी मामला है।कई किटों के मैनुअल को किसी ने नहीं पढ़ा, लेकिन उनमें से किसी ने भी इस विषय का उल्लेख नहीं किया।वास्तव में, यह बहुत महत्वपूर्ण है.आधारों का संयोजन मुख्यतः हाइड्रोजन बंधों की शक्ति पर निर्भर करता है।मजबूत हाइड्रोजन बांड सामान्य प्रवर्धन हैं, और कमजोर हाइड्रोजन बांड गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की ओर ले जाते हैं।यदि कमजोर हाइड्रोजन बांड को अच्छी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है, तो गैर-विशिष्ट प्रवर्धन से बचा नहीं जा सकता है।लेखक के दायरे में, केवल कुछ कंपनियों ने ही इस समस्या पर ध्यान दिया है।जब आप किट खरीदते हैं, तो आप यह उल्लेख कर सकते हैं कि जिस किट को आप चुनना चाहते हैं, उसके संबंध में आपने किसी समाधान पर विचार किया है या नहीं।

प्रतिक्रिया की मात्रा: 20-50ul प्रणाली का आमतौर पर अधिक उपयोग किया जाता है, और छोटी मात्रा में त्रुटियां होने की संभावना होती है।सामान्यतया, किट निर्देश पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा के उपयोग की सिफारिश करेंगे।होशियार न बनें और लागत बचाने के लिए छोटी मात्रा का उपयोग करें।का लक्ष्य।व्यापारियों द्वारा अनुशंसित मात्रा का वास्तव में परीक्षण किया गया है, और हो सकता है कि वे छोटी मात्रा के कारण होने वाली त्रुटियों की समस्या का समाधान नहीं कर सकें।
2. ट्यूब प्लेट का निर्माता और आर्टिकल नंबर
फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर के सिद्धांत को हर कोई जानता है।प्रतिदीप्ति संग्रह मुख्य रूप से पीसीआर ट्यूब कैप के माध्यम से किया जाता है।पीसीआर उपभोग्य सामग्रियों का चयन करते समय, दो बिंदुओं पर ध्यान दें: अच्छा प्रकाश संचरण और उपकरण के लिए उपयुक्त।सामान्यतया, मुख्यधारा के ब्रांडों के बोर्ड और ट्यूब ठीक हैं, लेकिन आपको अनुकूलन के संदर्भ में सावधानी से चयन करना होगा, अन्यथा आप उपकरण का उपयोग नहीं कर पाएंगे।

4. उच्चतम स्तर का ज्ञान

एमआईक्यूई (8)-क्यूपीसीआर सत्यापन
यह qपीसीआर की सर्वोच्च प्राथमिकता है!कितने ही वीर यहाँ की रेत में गिरे हैं।बेशक, यह भी संभव है कि आप भाग्यशाली हैं और जिन जीनों का आपने अध्ययन किया है वे सरल हैं, इसलिए आप हवा के साथ बर्फ की गुफा में तैरते रहे।क्यूपीसीआर की सत्यापन जानकारी का उद्देश्य डेटा की विश्वसनीयता का परीक्षण करना है।हम आवश्यक सत्यापन जानकारी इस प्रकार सूचीबद्ध करते हैं:

1. विशिष्टता परीक्षण
लक्ष्य जीन प्रवर्धन की विशिष्टता का परीक्षण यह जाँच कर किया जाता है कि क्या वैद्युतकणसंचलन चित्र एक एकल बैंड है;अनुक्रमण सत्यापन;यह देखने के लिए पिघलने वाला वक्र कि क्या शिखर मानचित्र एकल है;एंजाइम पाचन सत्यापन और अन्य तरीके।
यहां, हम टी पर ध्यान केंद्रित करते हैंउन्होंने पिघलने वाले वक्रों की विधि का उपयोग करके गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का विश्लेषण किया.सामान्यतया, जब हम प्राइमर डिज़ाइन करते हैं, तो उत्पाद के टुकड़े का आकार 80-200bp की सीमा में होना आवश्यक होता है, जिससे पीसीआर उत्पाद का पिघलने का तापमान 80-85 डिग्री सेल्सियस की सीमा में हो जाता है।इसलिए, यदि विविध शिखर हैं, तो अन्य गैर-विशिष्ट प्रवर्धन उत्पाद भी होने चाहिए;यदि शिखर 80°C से नीचे दिखाई देता है, तो इसे आम तौर पर प्राइमर डिमर माना जाता है;यदि शिखर 85°C से ऊपर दिखाई देता है, तो इसे आम तौर पर डीएनए संदूषण या बड़े टुकड़ों का अधिक गैर-विशिष्ट प्रवर्धन माना जाता है।
नोट: कभी-कभी 80°C पर केवल एक ही शिखर होता है।इस समय इसी अवधारणा का पालन करना होगा.यह संभावना है कि प्रवर्धन परिणाम सभी प्राइमर डिमर हैं।

सामान्य पिघलने का वक्र (बिना किसी गैर-विशिष्ट प्रवर्धन के एकल शिखर)

समस्याग्रस्त पिघलने का वक्र (नकली चोटियों का गैर-विशिष्ट प्रवर्धन)
【केस विश्लेषण】

एक मुख्य शिखर है, लेकिन प्राइमर डिमर गंभीर है
नीचे दिए गए चित्र में एकल-शिखर पिघलने वाला वक्र आसानी से आपकी आंखों को धोखा दे सकता है, यह सोचकर कि यह एक आदर्श प्रयोग है, लेकिन परिणाम पूरी तरह से गलत है।इस समय हमें पिघलने वाले तापमान को देखना होगा.अधिकतम तापमान 80 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, जो पूरी तरह से प्राइमर-डिमर है।

कोई लक्ष्य खंड नहीं, सभी प्राइमर डिमर
यहाँ, मेरा भाई नहीं रुक सकता.नीचे दी गई तस्वीर एक बदमाश द्वारा मुझे भेजी गई मोबाइल फोन से ली गई तस्वीर है।उन्होंने जिन अभिकर्मकों का उपयोग किया वे सभी उद्योग में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ब्रांड हैं।वह एक टी-उपसर्ग ब्रांड से दूसरे टी-उपसर्ग ब्रांड में बदल गया।मुझे लगता है कि आपने पहले ही इसका अनुमान लगा लिया है।बदमाश ने चिल्लाकर मुझसे कहा: “पहली तस्वीर में इस्तेमाल किया गया अभिकर्मक बहुत अच्छा है, और शिखर एकल है।बाद में, आपके द्वारा अनुशंसित अभिकर्मक का उपयोग करने के बाद, यह मिश्रित चोटियों के साथ दूसरी तस्वीर जैसा बन जाता है।तुमने मुझे दुखी कर दिया है.“
दोनों ग्राफ़ अलग करें.पहली नज़र में, एक में एक शिखर है, और दूसरे में दोहरा शिखर है।बकवास, एक शिखर बिल्कुल ठीक है।क्या वह सच है?
डू ई से भी बदतर, अगर मैं नीचे दी गई तस्वीर में दो तस्वीरें डालूं, तो आप तुरंत समझ जाएंगे।दरअसल, इस तरह की तस्वीर से हम आसानी से चकित हो जाते हैं।सावधानीपूर्वक विश्लेषण के बाद, हमने पाया कि: पहले आंकड़े का शिखर 75°C पर है, जो पूरी तरह से प्राइमर डिमर है;दूसरे आंकड़े का शिखर 75°C और 82°C पर दिखाई देता है, कम से कम वहाँ उत्पाद दिखाई देता है।

छात्रों से प्रतिक्रिया की तस्वीरें
तो मूल समस्या अभिकर्मकों की समस्या नहीं है, बल्कि प्राइमर डिज़ाइन की समस्या है।साथ ही, यह यह भी साबित करता है कि कुछ बड़े ब्रांड लौह गुणवत्ता के नहीं हैं, और यह यह भी साबित करता है कि मेरे भाई ने पहले क्या कहा था: यह अभिकर्मक ब्रांड नहीं है जो आपके लेख का समर्थन करता है।यह आपका लेख है जिसने अभिकर्मकों के ब्रांड को बढ़ावा दिया है।ज़रा सोचिए, अगर बदमाश ने अभिकर्मकों को नहीं बदला, तो गलत डेटा जर्नल में भेज दिया जाएगा, और जो होगा वह एक त्रासदी होगी।
2. रिक्त नियंत्रण का सीटी मान
स्पष्ट न करें, यदि रिक्त नियंत्रण में Ct मान है, तो क्या यह प्रदूषण नहीं है?हालाँकि, आपको अभी भी यह समझने की आवश्यकता है कि किस रिक्त नियंत्रण का Ct मान है।यदि यह एनटीसी है, तो इसका मतलब है कि इसमें अभिकर्मक संदूषण जैसे विदेशी डीएनए है।यदि यह एनआरटी है, तो इसका मतलब है कि निकाले गए आरएनए में डीएनए संदूषण है।
3. मानक वक्र
ढलान और गणना सूत्र को शामिल करते हुए, पीसीआर दक्षता की गणना सूत्र के माध्यम से की जा सकती है।एक आदर्श प्रयोग के लिए मानक वक्र के ढलान को 3.32 तक और R² को 0.9999 तक पहुंचने की आवश्यकता होती है।
4. रैखिक गतिशील रेंज
प्रतिक्रिया की गतिशील सीमा रैखिक है।मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए गए टेम्पलेट के अनुसार, गतिशील रेंज में कम से कम 5 एकाग्रता ग्रेडिएंट शामिल होने चाहिए, और उच्च एकाग्रता ग्रेडिएंट और कम एकाग्रता ग्रेडिएंट पर सीटी मानों के परिवर्तन पर ध्यान देना चाहिए।
5. पता लगाने की सटीकता
क्यूपीसीआर परिणामों में परिवर्तन, यानी खराब दोहराव, यानी खराब परिशुद्धता, तापमान, एकाग्रता और संचालन सहित कई कारकों के कारण होता है।प्रतिलिपि संख्या घटने पर क्यूपीसीआर परिशुद्धता आम तौर पर कम नियंत्रणीय हो जाती है।आदर्श रूप से प्रायोगिक भिन्नता के भीतर, यह तकनीकी भिन्नता जैविक भिन्नता से अलग होनी चाहिए, और जैविक प्रतिकृति समूहों या उपचारों के बीच क्यूपीसीआर परिणामों में सांख्यिकीय अंतर को सीधे संबोधित कर सकती है।विशेष रूप से नैदानिक ​​परीक्षणों के लिए, साइटों और ऑपरेटरों के बीच सर्वोत्तम अंतर-परख परिशुद्धता (दोहराव योग्यता) की सूचना दी जानी चाहिए।
6. जांच दक्षता और एलओडी (मल्टीप्लेक्स क्यूपीसीआर में)
पाए गए 95% सकारात्मक नमूनों में एलओडी सबसे कम सांद्रता है।दूसरे शब्दों में, लक्ष्य जीन प्रतिकृति के एक सेट के भीतर मौजूद LOD की सांद्रता विफल प्रतिक्रियाओं के 5% से अधिक नहीं होनी चाहिए।मल्टीप्लेक्स क्यूपीसीआर विश्लेषण करते समय, विशेष रूप से बिंदु उत्परिवर्तन या बहुरूपता का एक साथ पता लगाने के लिए, मल्टीप्लेक्स क्यूपीसीआर को सबूत देने की आवश्यकता होती है कि एक ही ट्यूब में एकाधिक लक्ष्य टुकड़ों की सटीकता से समझौता नहीं किया जाता है, एकाधिक पहचान और एकल ट्यूब पहचान दक्षता और एलओडी समान होनी चाहिए।खासकर जब उच्च-सांद्रता लक्ष्य जीन और कम-सांद्रता लक्ष्य जीन एक साथ प्रवर्धित होते हैं, तो इस समस्या पर ध्यान दिया जाना चाहिए।
समस्याएँ और समाधानसामान्यतया, क्यूपीसीआर डिबगिंग में अक्सर आने वाली समस्याएं निम्नलिखित पहलुओं पर केंद्रित होती हैं:
·अविशिष्ट प्रवर्धन
·प्राइमर सांद्रण का कठिन चयन और प्राइमर-डाइमर के साथ परेशानी
·एनीलिंग तापमान गलत है
·माध्यमिक संरचना प्रवर्धन दक्षता को प्रभावित करती है
निरर्थक प्रवर्धन
गैर-विशिष्ट प्रवर्धनहोता है, तो आम तौर पर यह माना जाता है कि क्या प्राइमर डिज़ाइन उपयुक्त नहीं है, लेकिन यदि आप प्राइमर बदलने की जल्दी में नहीं हैं, तो आप पहले निम्नलिखित तरीकों को आज़मा सकते हैं (सिद्धांत भी संलग्न है):
·एनीलिंग तापमान बढ़ाएँ - कमजोर हाइड्रोजन बांड को बनाए रखने में असमर्थ बनाने का प्रयास करें;
·एनीलिंग और बढ़ाव का समय कम करें - कमजोर हाइड्रोजन बांड की संभावना कम करें;
·प्राइमर सांद्रता कम करें - अनावश्यक प्राइमरों और गैर-लक्षित क्षेत्रों के बंधन की संभावना कम करें;
कम प्रवर्धन दक्षता
गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की विपरीत स्थिति - कम प्रवर्धन दक्षता, और कम प्रवर्धन दक्षता से निपटने के उपाय इसके ठीक विपरीत हैं:
·एनीलिंग और बढ़ाव का समय बढ़ाना;
·तीन-चरण पीसीआर में बदलें और एनीलिंग तापमान कम करें;
·प्राइमर की सघनता बढ़ाएँ;
Ps: 90 के दशक में पैदा हुए कई स्नातक छात्र प्रयोगों को डिबग करने के तरीके का अध्ययन करने के लिए तैयार नहीं हैं, और उम्मीद करते हैं कि किट समस्या को पूरी तरह से हल कर सकती है (यदि आप स्नातक होने के बाद अनुसंधान और विकास करने के लिए एक अभिकर्मक कंपनी में जाना चाहते हैं), वास्तव में, अभिकर्मक निर्माता भी इस तरह सोचते हैं, मुझे आशा है कि यह मूर्खतापूर्ण है जब आप इसे प्राप्त करते हैं तो इसका उपयोग किया जा सकता है, इसलिए अभिकर्मक निर्माताओं ने गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की समस्या को हल करने के लिए बहुत प्रयास किए हैं, जिसमें कमजोर एच-बॉन्ड अवशोषण कारकों की शुरूआत भी शामिल है।समस्या को आसानी से हल करने के लिए, मूर्खों को अभी भी अभिकर्मक कंपनी का परिचय पढ़ना होगा, यह देखने के लिए कि क्या कोई ऐसा कारक है जो कमजोर हाइड्रोजन बांड को अवशोषित करता है।
प्राइमर सांद्रण का कठिन चयन और प्राइमर-डाइमर के साथ परेशानी
विधि 1: सामान्यतया, क्यूपीसीआर के लिए किट निर्देशों में अनुशंसित सिस्टम और प्राइमर सांद्रता की सिफारिश की गई है।
विधि 2: प्राइमर सांद्रण ग्रेडिएंट सेट करके डिबगिंग।स्पष्ट करने के लिए नीचे दी गई तस्वीर एक कंपनी से चुराई गई है।नीचे दिया गया आंकड़ा तीन प्राइमर एकाग्रता ग्रेडिएंट्स (100nM, 250nM, 500nM) और चार टेम्पलेट एकाग्रता ग्रेडिएंट्स (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) के साथ बनाए गए प्रतिदीप्ति मात्रात्मक परिणाम दिखाता है।प्रयोगात्मक परिणामों का सीटी मान निम्नानुसार प्लॉट किया गया है:

प्राइमर सांद्रण चयन प्रत्येक प्राइमर सांद्रण को निम्नानुसार एक पंक्ति में जोड़ें:

प्राइमर सांद्रण का विकल्प स्पष्ट है, 100nM और 250nM के प्राइमर सांद्रण का रैखिक संबंध बेहतर है, और 500nM के प्राइमर सांद्रण का रैखिक संबंध अपेक्षाकृत खराब है।100nM और 250nM में, 250nM का Ct मान अपेक्षाकृत छोटा है, इसलिए इष्टतम प्राइमर सांद्रता 250nM है।आमतौर पर पिघलने वाले वक्र में गंभीर प्राइमर-डिमर देखे जा सकते हैं।यदि डिज़ाइन किए गए प्राइमर प्राइमर-डिमर्स से बच नहीं सकते तो क्या होगा?
विधि 3: प्राइमर की मात्रा कम करें और एनीलिंग तापमान बढ़ाएँ (स्पष्ट करने की कोई आवश्यकता नहीं)।
एनीलिंग तापमान का अनुभवजन्य मूल्य 60°C है।यदि आप निश्चित नहीं हैं, तो अधिक उपयुक्त एनीलिंग तापमान का चयन कैसे करें?इसका उत्तर प्राइमर सांद्रण के विकल्प के समान ही है -ग्रेडियेंट परीक्षण.समस्या को स्पष्ट करने के लिए बायो-रेड कंपनी से एक तस्वीर लें।एक निश्चित लक्ष्य टुकड़े के प्रवर्धन के लिए, आठ तापमान प्रवणता निर्धारित करें, प्रत्येक तीन पुनरावृत्ति के साथ, और प्राप्त प्रवर्धन वक्र इस प्रकार है:

एनीलिंग तापमान चयन:
·70°C, 69°C—मूल रूप से, प्राइमरों को संयोजित नहीं किया जा सकता है, इसलिए कोई प्रवर्धन नहीं होता है।
·67.3°C - शुरुआत में थोड़ी मात्रा में प्रवर्धन होता है, और Ct मान अपेक्षाकृत बड़ा होता है।
·64.5°C——सीटी मान घट जाता है।
·60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, और 55.0°C पर, सीटी मान मूल रूप से स्थिर होते हैं, लेकिन अंतिम प्रतिदीप्ति मान भिन्न थे।
कैसे चुने?सिद्धांत: पहला सिद्धांत उच्च सीटी मान है।समान सीटी मान के लिए, डिमराइजेशन और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन से बचने के लिए उच्च एनीलिंग तापमान चुनें।हालाँकि 55°C पर प्रतिदीप्ति मान अधिक होता है, इसमें डिमर या गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हो सकता है।
लेकिन अगर आप उतने ही स्मार्ट हैं, तो आप निश्चित रूप से सोचेंगे: तार्किक रूप से कहें तो, यदि पीसीआर प्रतिक्रिया बहुत विशिष्ट है, जब तक प्राइमर एकाग्रता न्यूनतम आवश्यकता से अधिक है, फ्लोरोसेंट रंगों और डीएनटीपी की तरह, उच्च और निम्न बिंदुओं का कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए।दरअसल, जब तक एनीलिंग तापमान को ठीक से अनुकूलित किया जाता है, तब तक सीटी मान पर प्राइमर एकाग्रता का प्रभाव स्वाभाविक रूप से कम हो जाएगा।

एनीलिंग तापमान ठीक से अनुकूलित किया गया है, और सीटी पर प्राइमर एकाग्रता का प्रभाव कम हो जाएगा
द्वितीयक संरचना प्रवर्धन दक्षता को प्रभावित करती है
आइए समस्या को स्पष्ट करने के लिए बायो-रेड से चित्र लें।यह एक द्वितीयक संरचना वाले जीन को बढ़ाने के लिए एक तापमान प्रवणता भी डिज़ाइन करता है।

द्वितीयक संरचना उभरती है
यह देखा जा सकता है कि जैसे-जैसे तापमान प्रवणता घटती है, उत्पाद दिखाई देने लगते हैं और Ct मान आगे बढ़ता है, न्यूनतम मान 60.7°C तक पहुँच जाता है, और फिर जैसे-जैसे तापमान प्रवणता घटती है, Ct मान बड़ा हो जाता है।इसके विपरीत, जैसे-जैसे तापमान बढ़ता है, द्वितीयक संरचना खुलती है और प्रवर्धन दक्षता बढ़ती है।एक निश्चित तापमान तक पहुंचने के बाद, तापमान बढ़ाने से प्रवर्धन दक्षता में सुधार नहीं हो सकता है।क्योंकि इस समय प्राइमरों को स्थिर रूप से संयोजित नहीं किया जा सकता है।इसलिए,न्यूनतम Ct मान वाले तापमान की तलाश करें, जो द्वितीयक संरचना टेम्पलेट को प्रवर्धित करने के लिए सबसे अच्छा तापमान है!बेशक, चतुर मूर्खों को पता होना चाहिए कि यदि यह आवश्यक नहीं है, तो प्राइमर को बदलना और द्वितीयक संरचना क्षेत्र से बचना सबसे अच्छा है।
5. आवेदन स्तर
MIQE-डेटा विश्लेषण

डेटा विश्लेषण मुख्य रूप से फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर उपकरण द्वारा दिया जाता है।पिछले लेख में, बहुत सारे डेटा विश्लेषण कार्य किए गए हैं, जैसे कि रिक्त नियंत्रण, जिसे प्रयोग के डिज़ाइन में समझाया गया है।आंतरिक संदर्भ जीन, दोहराव संख्या आदि को स्पष्ट किया गया है।, यहां हम मुख्य रूप से क्यूपीसीआर के अनुप्रयोग की व्याख्या करते हैं।
क्यूपीसीआर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, और प्रयोगात्मक सत्यापन और न्यूक्लिक एसिड निदान सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले परिदृश्य हैं।
पूर्ण परिमाणीकरण
लॉग (प्रारंभिक एकाग्रता) का चक्रों की संख्या के साथ एक रैखिक संबंध है।ज्ञात प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या वाले मानक से एक मानक वक्र खींचा जा सकता है, अर्थात प्रवर्धन प्रतिक्रिया का रैखिक संबंध प्राप्त किया जा सकता है।नमूने के सीटी मान के अनुसार, नमूने में एकाग्रता की गणना की जा सकती है।शामिल करने के लिए टेम्पलेट्स की मात्रा.

पूर्ण मात्रात्मक गणना विधि
पूर्ण परिमाणीकरण मानक वक्र पर आधारित होना चाहिए।मानक वक्र बनाने के लिए एक मानक की आवश्यकता होती है।आमतौर पर, मानक लक्ष्य जीन की क्लोनिंग द्वारा प्राप्त प्लास्मिड होता है।यह प्लास्मिड क्यों है?क्योंकि गोलाकार प्लास्मिड डीएनए सबसे अधिक स्थिर होता है।दोहरीकरण अनुपात (10 गुना कमजोर पड़ने) के अनुसार मानक उत्पाद को 5 से 6 ग्रेडिएंट में पतला करें, और पतला करते समय एकरूपता पर ध्यान दें।Ct मान को 15-30 के बीच आने दें।

मानक तैयारी
साथ ही, परीक्षण किए जाने वाले नमूने को भी तदनुसार पतला किया जाना चाहिए (कमजोर पड़ने वाले कारक को याद रखें), और सीटी मान भी 15-30 के बीच आना चाहिए।मानक उत्पाद + परीक्षण किए जाने वाले नमूने को एक साथ मशीन पर रखा जाता है।चलाने के बाद, मानक पदार्थ के साथ एक मानक वक्र बनाया गया था, और परीक्षण किए जाने वाले नमूनों को एकाग्रता की गणना करने के लिए मानक वक्र में लाया गया था।
हेपेटाइटिस बी वायरस एचबीवी मात्रा का ठहराव एक विशिष्ट पूर्ण मात्रा का ठहराव है, जो 1 मिलीलीटर रक्त में वायरस कॉपी संख्या की गणना कर सकता है।
प्रतिलिपि संख्या की गणना
परीक्षण किए जाने वाले नमूने की सांद्रता (एनजी/उल) = OD260 × 50ug/ml × तनुकरण कारक
नमूना आणविक भार = आधारों की संख्या × 324
परीक्षण किए जाने वाले नमूने की प्रतिलिपि संख्या (प्रतियां/उल) = परीक्षण किए जाने वाले नमूने की सांद्रता/नमूने का आणविक भार × 6 × 1014

प्रतिलिपि संख्या की गणना विधि

मात्रा निर्धारित करने के लिए उपरोक्त गणना विधि है।यह एक गणितीय समस्या है जिसे जूनियर हाई स्कूल से स्नातक होने के बाद हल किया जा सकता है, और गणितीय समस्याएं आम तौर पर कंप्यूटर द्वारा हल की जाती हैं।यदि आप नहीं समझते हैं, तो आप संवाद करने आ सकते हैं।
सापेक्ष परिमाणीकरण
सापेक्ष परिमाणीकरण का उपयोग मुख्य रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान में किया जाता है।1 मिलीलीटर रक्त में कितने वायरस होते हैं, और यह एक डीएनए वायरस है, यह एक अपेक्षाकृत नियतात्मक घटना है: रक्त की मात्रा निर्धारित की जा सकती है, और डीएनए वायरस अपेक्षाकृत स्थिर है।हालाँकि, हमारे लिए एक पत्ती में एक निश्चित जीन की प्रतिलेखन प्रतियों की संख्या की तुलना करना मुश्किल है, क्योंकि पत्ती के आकार, वजन और कोमलता को निर्धारित करना मुश्किल है, निकाले गए आरएनए की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल है, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की दक्षता निर्धारित करना भी मुश्किल है, यानी, कोई भी कदम प्रयोगात्मक डेटा में बग बना सकता है और इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है।
इसलिए, सापेक्ष परिमाणीकरण में एक तत्व का परिचय होना चाहिए:आंतरिक संदर्भ जीन.
दूसरे शब्दों में, सापेक्ष परिमाणीकरण वास्तव में लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन के बीच तुलना है।समान ऊतक और समान कोशिका की तुलना में, नमूना आकार, आरएनए निष्कर्षण मात्रा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता और पीसीआर दक्षता का प्रभाव अपेक्षाकृत छोटा है।छोटे नमूने के आकार के कारण, आंतरिक संदर्भ जीन और लक्ष्य जीन दोनों अपेक्षाकृत कम हो गए थे।यही कारण है कि हम पहले भी एकरूपता और स्थिरता पर जोर देते रहे हैं।
आंतरिक संदर्भ जीन आम तौर पर होते हैंहाउसकीपिंग जीन(हाउस-कीपिंग जीन), जो जीन के एक वर्ग को संदर्भित करता है जो सभी कोशिकाओं में स्थिर रूप से व्यक्त होते हैं, और उनके उत्पाद कोशिकाओं की बुनियादी जीवन गतिविधियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक होते हैं।
इस अवधारणा को भ्रमित मत करो.हाउसकीपिंग जीन जैविक कार्य शब्द हैं, जबकि आंतरिक संदर्भ जीन प्रयोगात्मक तकनीकी शब्द हैं।हाउसकीपिंग जीन को आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में चुने जाने से पहले सत्यापन पारित करने की आवश्यकता होती है।
उदाहरण के लिए, हमने विभिन्न ऊतक कोशिकाओं में उनकी अभिव्यक्ति के स्तर का परीक्षण करने के लिए नीचे दिए गए चित्र में कई हाउसकीपिंग जीनों का चयन किया, और पाया कि β-2-माइक्रोग्लोबुलिन की अभिव्यक्ति का स्तर अन्य तीन जीनों से काफी अलग था, इसलिए उन्हें आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता था।

आंतरिक संदर्भ जीन के सुधार कार्य को समझने के बाद, आंतरिक संदर्भ जीन की शुरूआत के कारण दो एल्गोरिदम प्राप्त होते हैं।
·दोहरी मानक वक्र विधि
·2 – △△सीटी विधि (सीटी मूल्य तुलना विधि)
यदि आप प्रजातियों और जीन कार्यों का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं, तो कृपया एल्गोरिदम पर शोध छोड़ दें और सीधे सूत्रों का उपयोग करें, या सीधे मशीनों का उपयोग करें;यदि आप गणित और इंजीनियरिंग में सीधे व्यक्ति हैं, तो कृपया स्वतंत्र महसूस करें।
दोहरी मानक वक्र विधि
नियंत्रण नमूने के लक्ष्य जीन और हाउसकीपिंग जीन और मानक वक्र के माध्यम से परीक्षण किए जाने वाले नमूने की मात्रा निर्धारित करें, और फिर गणना सूत्र के अनुसार सापेक्ष मूल्य की गणना करें, जो कि सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर है।
लाभ: सरल विश्लेषण, अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक अनुकूलन
नुकसान: प्रत्येक जीन के लिए, प्रयोगों के प्रत्येक दौर में एक मानक वक्र बनाना होगा
अनुप्रयोग: जीन अभिव्यक्ति विनियमन के अध्ययन में दो सबसे अधिक इस्तेमाल और मान्यता प्राप्त सापेक्ष मात्रात्मक तरीकों में से एक
सूत्र इस प्रकार है:

उदाहरण इस प्रकार हैं:

मात्रात्मक परिणाम के आधार पर सापेक्ष राशि की गणना करें
2 - △△सीटी विधि (सीटी मूल्य तुलना विधि)

लाभ: मानक वक्र बनाने की आवश्यकता नहीं
नुकसान: यह माना जाता है कि प्रवर्धन दक्षता 100% के करीब है;मानक विचलन <5% है, और प्रत्येक प्रवर्धन के बीच मानक वक्र और दक्षता को सुसंगत माना जाता है;प्रायोगिक स्थितियों का अनुकूलन अधिक जटिल है।
अनुप्रयोग: जीन अभिव्यक्ति विनियमन के अध्ययन में दो सबसे अधिक इस्तेमाल और मान्यता प्राप्त सापेक्ष मात्रात्मक तरीकों में से एक

बेशक, प्रवर्धन दक्षता आमतौर पर पूरी तरह से असंभव है 1. सुधार विधि: यदि हम जानते हैं कि लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन में समान प्रवर्धन दक्षता है, लेकिन प्रवर्धन दक्षता 1 के बराबर नहीं है, तो 2－△△Ct को इस प्रकार ठीक किया जा सकता है: (1+E )－△△Ct, उदाहरण के लिए, यदि प्रवर्धन दक्षता 0.95 है, तो गणना सूत्र को 1.95 तक सही किया जा सकता है －△△सीटी
अब तक, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर के बारे में सामग्री समाप्त हो गई है।